【摘要】：嚴重燒傷可造成全身多臟器損傷和功能下降，特別是燒傷合并多器官功能障礙綜合征，是導致病人死亡的主要原因。雖然燒傷后各器官結構和功能損傷的確切機制仍然不完全明了，但諸多研究表明，燒傷后局部微環(huán)境改變與組織器官修復和再生關系密切；特別是缺血、缺氧及炎性介質大量釋放和氧自由基產(chǎn)生是導致多器官功能衰竭的重要原因。目前已有研究表明在受損后應用間充質干細胞可以有效改善損傷局部微環(huán)境，從而促進細胞活性以及修復損傷組織。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有增殖和多向分化潛能的一類多能干細胞，可從胎兒血液、肝臟、骨髓、脂肪等多種組織獲得，是一群多潛能細胞，可以向多種組織如骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪及基質細胞增殖分化。臨床上利用MSCs移植治療某些疾病也已取得較好效果。 目前，，在針對組織再生與修復的各項研究中，自體骨髓間充質干細胞(Bonemarrow derived-MSCs，BMMSCs)的研究和應用最為廣泛，在體修復損傷組織的技術方法已經(jīng)建立及得到應用。然而，骨髓間充質干細胞的獲取須行骨髓穿刺術，給供者造成一定痛苦，且骨髓間充質干細胞的增殖及分化潛能隨供者年齡的增大而下降。而且以往對MSCs的應用在損傷組織再生修復研究中僅限于后期的治療，在急性燒傷等需早期治療中往往受到細胞培養(yǎng)周期的限制而無法及時使用。因此尋找新的MSC來源成為國內外干細胞研究領域的熱點。目前，臍帶來源間充質干細胞(umbilical cord derived-MSCs，UCMSCs)的多向分化潛能已得到證實，而且具有來源廣泛、免疫反應低、分化潛能大等多種優(yōu)勢，因此，可以將UCMSCs作為一種嶄新的細胞治療策略應用于燒傷后器官損傷修復再生研究。 嚴重燒傷所導致的不同臟器損傷的發(fā)生與發(fā)展與嚴重程度也不盡相同，其中腎臟組織損傷是較早出現(xiàn)的并發(fā)癥。腎臟組織損傷的發(fā)生與多種細胞因子、嘌呤池耗竭、自由基的生成增多和清除能力減弱、能量代謝障礙、細胞凋亡和壞死等多種因素的作用有關。近期研究表明MSCs能夠參與炎癥組織的細胞遷移，并通過產(chǎn)生多種再生因子，引起組織及浸潤在黏膜內活化的巨噬細胞失活，并通過促進宿主自身細胞增殖修復損傷組織。這也提示UCMSCs可能對早期重度燒傷動物具有較好的保護效應。為探討UCMSCs在嚴重創(chuàng)傷后具體器官或組織中的具體作用以及其機制，本研究采用重度燒傷大鼠模型，觀察UCMSCs對傷后腎臟可能產(chǎn)生的作用，為UCMSCs應用于燒傷后腎臟損傷的保護及機制研究奠定基礎。另外，燒傷后的急性肺損傷是傷后導致的急性進行性缺氧性呼吸功能不全，也是導致患者死亡的主要原因。但由于肺部結構的復雜性和易感染性，目前干細胞用于治療肺部疾病的研究落后于其他器官。已有文獻證實腫瘤壞死因子-α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）等炎性介質的合成釋放,中性粒細胞等在肺內積聚,補體激活,氧自由基產(chǎn)生等所導致的一系列病理改變在其發(fā)病機制中起重要作用。基于此，本研究采用燒傷與細菌感染的雙重模型，試圖探討UCMSCs對創(chuàng)傷后急性肺損傷的保護效應及可能機制。本研究結果有望為干細胞應用于燒傷后臟器的損傷保護及其機制研究奠定實驗基礎。 本實驗主要由以下三部分內容組成： 一、分離培養(yǎng)獲取UCMSCs及對其細胞生物學特性實驗研究。在本實驗中，采用膠原酶消化與組織貼壁相結合的方法，分離獲取臍帶沃頓膠（Wharton’s Jelly）來源的間充質干細胞，采用流式細胞術檢測細胞的表面抗原的表達、分析細胞的增殖活性；同時采用細胞化學法鑒定細胞的多向分化潛能（脂肪、骨及軟骨細胞）。結論：臍帶沃頓膠（Wharton’ Jelly）中分離、提取的UCMSCs陽性表達間充質干細胞標記物抗原（CD29、CD44、CD90、CD105），陰性表達造血細胞系標記物CD34。UCMSCs能夠分化為堿性磷酸酶染色陽性的骨細胞、II型膠原抗體染色陽性的軟骨細胞以及油紅-O染色陽性的脂肪細胞。經(jīng)四甲基偶氮唑鹽（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）檢測法發(fā)現(xiàn)，UCMSCs具有較強的細胞增殖能力。 二、UCMSCs對重度燒傷大鼠腎臟保護作用的研究。 在本實驗中，取已獲取并鑒定的P3-P7代UCMSCs靜脈注射20%總體表面積（total body surface area，TBSA）III度燒傷大鼠模型：其中以烏斯他汀治療為陽性對照組、注射等量體積的生理鹽水組為陰性對照組。燒傷后大鼠模型愈合后，用冰凍切片法與免疫組織化學染色法在熒光顯微鏡下觀察UCMSCs在大鼠腎臟中分布特征，生化試驗檢測其修復治療的治療效果。結論：經(jīng)與陽性對照組、陰性對照組比較后發(fā)現(xiàn)，燒傷后7、14d的組織病理學觀察顯示，干細胞移植后的大鼠燒傷后腎臟組織充血、腫脹等病理學改變較烏司他丁組及生理鹽水組有所減輕，隨時間延長減輕更加明顯；免疫組化觀察顯示UCMSCs組傷后7d和14d腎組織中Bcl-2的表達較烏司他丁組和生理鹽水組明顯增多，表明腎組織抗凋亡能力增強。大鼠燒傷后血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和肌酐（creatinine，Cr）均較正常對照組顯著升高。烏司他丁治療組7d和14d BUN和Cr較生理鹽水組均明顯下降。UCMSCs組傷后7d和14d BUN和Cr均明顯下降，與生理鹽水組和烏司他丁組比較差異均有顯著性（P0.05），顯示干細胞治療對腎功能有明顯改善作用。UCMSCs移植可有效減輕重度燒傷后大鼠腎臟組織的損傷并改善腎臟功能。 三、UCMSCs對創(chuàng)傷后早期急性肺損傷作用的研究 在本實驗中取已獲取并鑒定的P3-P7代UCMSCs靜脈注射20%TBSAIII度燒傷大鼠模型（注射大腸桿菌內毒素）：其中以烏斯他汀治療為陽性對照組、注射等量體積的生理鹽水組為陰性對照組、注射UCMSCs為實驗組。采用冰凍切片法與免疫組織化學染色法在熒光顯微鏡下觀察UCMSCs在大鼠肺中分布特征，生化試驗檢測其修復治療的治療效果。結論：經(jīng)與陽性對照組、陰性對照組比較后發(fā)現(xiàn)，燒傷后7、14d的組織病理學觀察顯示，臍帶間充質干細胞能改善創(chuàng)傷性急性肺損傷動物的血氣，不同程度降低外周血TNF-α及支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavage fluid，BALF）中TNF-α、C3a、C5a和白蛋白含量,抑制肺組織TNF-α的蛋白表達，減輕內臟組織的損傷程度。病理學觀察干細胞移植后的大鼠燒傷后肺組織充血、腫脹等病理學改變較烏司他丁組及生理鹽水組有所減輕，隨時間延長減輕更加明顯。證明臍帶間充質干細胞能減少組織及血漿TNF-α的生成及含量，降低TNF-α等細胞因子介導的多器官組織損害,在一定程度上對創(chuàng)傷后早期急性肺損傷起保護作用，并緩解MODS的發(fā)生發(fā)展。
【圖文】：

解放軍醫(yī)學院碩士學位論文采用酶解法和組織塊貼壁培養(yǎng)法由人臍帶沃頓膠(Wharton’s Jelly)中分離提取的原代間充質干細胞（hUCMSCs）多于 24-48h 內貼壁；培養(yǎng) 3-5 天后，倒置顯微鏡下可見貼壁生長的細胞呈梭形、多角形。隨著培養(yǎng)時間的延長，可見細胞呈成纖維細胞樣克隆性增殖，細胞大小較均一，以梭形細胞為主，呈平行或漩渦狀生長，經(jīng)過 10-14 天的培養(yǎng)后融合率可達 80-90%（見圖 3.1）。

圖 3.2 流式細胞術檢測臍帶間充質干細胞（hUCMSCs）的抗原表達特征。hUCMSCs 陽性達：CD29、CD44、CD90、CD105、Oct-4；陰性表達：CD34。（三）臍帶間充質干細胞多向分化潛能人臍帶間充質干細胞在進行多向分化誘導前一般呈梭形、成纖維細胞樣hUCMSCs 在成骨分化誘導培養(yǎng)基培養(yǎng) 21 天后，經(jīng)鈣鈷法堿性磷酸酶染色可見胞染色呈黑色，黑色顆粒大小不一，提示有鈣化顆粒形成，未在成骨誘導培養(yǎng)中培養(yǎng)的對照組細胞堿性磷酸酶染色結果為陰性。UCMSCs 經(jīng)脂肪誘導培養(yǎng)基養(yǎng) 21 天后顯微鏡下可見細胞胞漿內有脂滴形成，用油紅-O 染色結果為陽性，而經(jīng)過脂肪誘導在普通間充質干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞無脂滴形成，油紅-O 染陰性。hUCMSCs 在軟骨分化誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng) 2-3 周后，采用免疫組織化學法測 II 型膠原抗體時發(fā)現(xiàn)，細胞胞漿染色呈棕黃色，而未經(jīng)軟骨分化誘導培養(yǎng)基導的細胞免疫組織化學染色結果為陰性，提示無軟骨細胞形成（見圖 3.3）。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R644

【參考文獻】

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本文編號：2551188