【摘要】：研究背景 嚴(yán)重的創(chuàng)燒傷常見于各類工業(yè)事故和頻發(fā)的恐怖襲擊及自然災(zāi)害，此類患者的治療因自體健康組織量有限常成為臨床修復(fù)重建的難點。國內(nèi)外修復(fù)重建外科領(lǐng)域針對此類患者創(chuàng)傷的修復(fù)公認(rèn)為異體復(fù)合組織移植有著不可替代的優(yōu)勢，然而眾所周知，這些患者需要長期使用免疫抑制藥物，而此類藥物的作用靶點為全身免疫系統(tǒng)，，也就意味著將會給患者帶來各種藥物副反應(yīng)，例如機會性感染等，更有甚者可能發(fā)生惡性腫瘤，這無疑大大限制了這項技術(shù)的發(fā)展。所以探索抑制免疫排斥反應(yīng)的新途徑，減少甚至設(shè)法避免免疫抑制藥物的應(yīng)用，是亟待解決的重大臨床問題之一。 BMSCs具有低免疫原性及免疫負(fù)性調(diào)節(jié)特性，但其免疫調(diào)節(jié)作用尚不能完全抑制移植排斥反應(yīng)。IDO對效應(yīng)T細(xì)胞具有促凋亡、抑增殖的作用，同時還可以誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生。但正常情況下，IDO在BMSCs中不表達(dá)或低表達(dá)，使得BMSCs的免疫調(diào)節(jié)能力不能完全發(fā)揮。據(jù)此，本研究擬通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建高表達(dá)IDO的BMSCs（IDO-BMSCs），在體外研究其對異基因T淋巴細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)一步將IDO-BMSCs輸入受體鼠體內(nèi)，同時進(jìn)行異體復(fù)合組織移植，觀察IDO-BMSCs對移植排斥/耐受形成的影響。從而有望為異體復(fù)合組織移植免疫排斥反應(yīng)尋求新的治療方法，也為BMSCs作為細(xì)胞載體在移植排斥研究領(lǐng)域的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。 方法 1.通過全骨髓培養(yǎng)法從幼年BN大鼠骨髓中分離BMSCs，通過對細(xì)胞形態(tài)及生物學(xué)特性的觀察，進(jìn)行純化、擴增以確立穩(wěn)定的擴增體系。進(jìn)一步鑒定BMSCs表面抗原與誘導(dǎo)分化能力。 2.構(gòu)建IDO(GFP)慢病毒包裝載體，不同滴度轉(zhuǎn)染大鼠來源BMSCs，篩選最佳感染指數(shù)MOI值。測定轉(zhuǎn)染效率及培養(yǎng)體系中IDO活性，同時檢測IDO-BMSCs中mRNA及蛋白水平表達(dá)量變化，通過建立IDO-BMSCs與同種異基因T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)體系，驗證其對T淋巴細(xì)胞增殖的影響。 3.建立大鼠異體后肢復(fù)合組織移植模型，觀察在降階梯環(huán)孢霉素A（CsA）的干預(yù)下肢體存活時間的變化。用CM-Dil染料標(biāo)記BMSCs后經(jīng)尾靜脈輸入受體大鼠，取移植組織冰凍切片示蹤，進(jìn)一步觀察IDO-BMSCs輸入受體鼠后對肢體存活時間的影響。 結(jié)果 1.原代BMSCs培養(yǎng)36小時即可貼壁。3-5天后表現(xiàn)為集落樣生長，7天后即可達(dá)80％的融合率。傳代后細(xì)胞生長較前加快，3天即可單層匯合。所培養(yǎng)BMSCs細(xì)胞表型鑒定符合且在特定培養(yǎng)基誘導(dǎo)下具有多向分化能力。 2.成功構(gòu)建IDO慢病毒載體并篩選出最佳感染指數(shù)MOI為10時轉(zhuǎn)染BMSCs效率最高，可達(dá)80.7％。IDO-BMSCs在mRNA及蛋白水平穩(wěn)定高表達(dá)IDO，培養(yǎng)上清中IDO生物學(xué)活性明顯高于對照組（IDO-BMSCs，61.3±5.4μM vsGFP-BMSCs，5.0±0.9μMBMSCs，5.3±0.6μM，**P＜0.01）。在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系中IDO-BMSCs能明確抑制同種異基因T淋巴細(xì)胞增殖，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。 3.成功建立大鼠同種異基因肢體移植模型。并證實在降階梯的CsA免疫抑制方案下，異體肢體可長時間存活。而在IDO-BMSCs治療組與對照組比較可明顯延長移植物成活時間、降低排斥反應(yīng)（IDO-BMSCs,14.5±0.8天vs BMSCs,11.5±0.6天生理鹽水,9±0.3天，n=6， p0.05）。 結(jié)論 全骨髓培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)BMSCs表型穩(wěn)定，分化能力良好。CM-Dil標(biāo)記后體內(nèi)示蹤明確。BMSCs經(jīng)IDO-Lenti轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定表達(dá)IDO及相應(yīng)的生物學(xué)活性，IDO-BMSCs在體外實驗中能明確抑制同種異基因T淋巴細(xì)胞增殖，在體實驗可明顯延長移植物成活時間、降低排斥反應(yīng)。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R641;R644

【參考文獻(xiàn)】

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1 王瓊;劉婷;張耀林;陳冬梅;王立斌;李玉奎;魏軍;;人胎盤MSCs對異基因小鼠皮膚移植排斥的免疫調(diào)節(jié)作用[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2013年07期

本文編號：2468163