【摘要】：研究背景創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)發(fā)病率,致死率及致殘率高,給社會帶來極大的負擔。根據(jù)TBI病理生理過程分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷在損傷后立即導致腦組織擠壓變形,腦血流中斷或者改變、神經(jīng)元和膠質細胞毀損而死亡,這些損傷無法通過臨床措施實施干預,只能加強預防。繼發(fā)性損傷在原發(fā)性損傷后立即開始直至持續(xù)數(shù)月,局部神經(jīng)化學變化引起一系列生化改變,細胞損傷與修復,增殖與凋亡,代謝改變相互作用進而出現(xiàn)細胞生命終結事件。繼發(fā)性腦損傷的病理生理機制復雜,深入理解影響腦損傷的病理因素,對于TBI的病理理解及治療將會帶來新的啟示。研究證實自然界哺乳動物血壓、神經(jīng)內(nèi)分泌激素分泌、睡眠覺醒周期、體溫、尿量變化、褪黑素及生長因子、進食等各種生理、生化、代謝過程都遵循著大約24小時的周期性變化,稱為晝夜節(jié)律(circadian rhythms)。晝夜節(jié)律是各種生物對環(huán)境因素循環(huán)變化長期適應和演化的結果,其廣泛存在各種有機生命中,是自然界中重要的生命現(xiàn)象。晝夜節(jié)律基因調控包括神經(jīng)干細胞在內(nèi)的多種細胞增殖,參與修復重建、參與細胞周期進程、影響神經(jīng)遞質釋放及神經(jīng)可塑性。目前越來越多的流行病學和遺傳學數(shù)據(jù)顯示晝夜節(jié)律紊亂與多種疾病發(fā)生、發(fā)展及藥物治療效果密切相關,這些疾病包括認知功能障礙、癡呆及帕金森、心血管系統(tǒng)心絞痛、腦血管意外發(fā)生、代謝綜合征及胰島素抵抗、乳腺癌及藥物治療抵抗等。在腦損傷后患者面臨環(huán)境及病理損壞的影響,晝夜節(jié)律紊亂經(jīng)常發(fā)生。動物實驗及臨床研究表明腦損傷后晝夜節(jié)律基因表達失衡,因此我們推測晝夜節(jié)律調控大腦神經(jīng)功能,參與病理損傷過程,但是如何參與及潛在的病理機制尚不明確;同時研究發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律參與細胞周期進程,影響胰島素,糖皮質激素及抗腫瘤藥物的藥物空間分布及藥理效果。在神經(jīng)保護治療措施中,神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)能夠促進神經(jīng)細胞生長、分化,促進損傷細胞修復,NGF發(fā)揮生物學效應必須經(jīng)過其自身特異性受體介導,迄今主要發(fā)現(xiàn)兩種NGF受體:高親和力受體(Trk A)和低親和力受體(p75)。NGF與高親和力受體Trk A結合,發(fā)揮正性調節(jié)作用,維持神經(jīng)元生長、發(fā)育、分化,促進損傷神經(jīng)元修復;與低親和力受體p75結合發(fā)揮負性調節(jié)作用,誘導細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)Trk A和p75在腦組織中的表達受到晝夜節(jié)律的調控,呈現(xiàn)24h節(jié)律模式。但是在晝夜節(jié)律紊亂環(huán)境下,對NGF治療影響鮮見報道,我們提出假設在腦損傷狀態(tài)下晝夜節(jié)律紊亂影響Trk A、p75受體表達進而影響NGF治療效果。因此本研究將探討晝夜節(jié)律紊亂對大鼠腦損傷病理改變及對NGF治療效果的影響。我們首先建立大鼠腦損傷動物模型,采用燈光持續(xù)照射導致大鼠晝夜節(jié)律紊亂,連續(xù)干擾14天,觀察大鼠行為學、學習記憶能力的變化,觀察對細胞生存及神經(jīng)再生的影響;在腦損傷晝夜節(jié)律紊亂的基礎上給與NGF治療,檢測NGF受體表達及凋亡信號基因蛋白改變,明確星形膠質細胞及小膠質細胞在晝夜節(jié)律紊亂下對炎癥因子分泌的影響。本研究為通過外界環(huán)境影響腦損傷的預后,為我們臨床治療提供新的思路,同時也對NGF治療效果優(yōu)化有重要啟示。第一部分晝夜節(jié)律紊亂對大鼠腦損傷病理改變的影響目的:觀察晝夜節(jié)律紊亂對腦損傷病理改變及海馬神經(jīng)再生的影響材料與方法:制備大鼠顱腦損傷模型,采用正常明暗環(huán)境(Light/Dark,LD)和燈光持續(xù)照射(Light/Light,LL)兩種環(huán)境模式(即正常晝夜節(jié)律與晝夜節(jié)律紊亂),連續(xù)干預14天。實驗大鼠隨機分為4組:正常對照組(Sham/LD)、晝夜節(jié)律紊亂對照組(Sham/LL)、腦損傷/正常晝夜節(jié)律組(TBI/LD)、腦損傷/晝夜節(jié)律紊亂組(TBI/LL),造模后采用Brdu50mg/kg連續(xù)注射7天。采用神經(jīng)功能評分觀察大鼠行為學改變;平衡木平衡實驗及行走實驗檢測大鼠運動及平衡能力;水迷宮檢測大鼠學習記憶能力改變;14天取腦組織標本,計算腦損傷灶體積;Nissl染色觀察損傷區(qū)域周圍皮質及海馬區(qū)神經(jīng)元生存細胞數(shù)量;采用Brdu標記新生存活細胞、Ki-67標記增殖細胞、DCX標記新生未成熟神經(jīng)元細胞,免疫組化測定海馬DG區(qū)14天時新生細胞存活數(shù)量、細胞增殖情況及新生未成熟神經(jīng)元數(shù)量。結果:1.對比各組大鼠體重、飲水及攝食量發(fā)現(xiàn),14天時與Sham/LD組相比,Sham/LL組大鼠體重、攝食量明顯增加(P0.05),飲水量無差異(P0.05);TBI/LD組與Sham/LD組相比,體重及神經(jīng)功能評分降低(P0.05);TBI/LL組與TBI/LD組相比體重、攝食及神經(jīng)功能評分均降低(P0.05)。2.平衡木實驗及水迷宮實驗結果顯示與Sham/LL組相比,TBI/LD組平衡運動能力降低,學習記憶能力受到明顯損害(P0.05);TB/LL組大鼠較TBI/LD組大鼠平衡能力、運動協(xié)調及認知功能進一步下降(P0.05)。3.經(jīng)Nissl染色計算損傷灶體積結果顯示TBI/LL組損傷體積明顯大于TBI/LD組(34.33±1.58mm3 VS 23.97±2.94mm3,P0.05);同時TBI/LL組腦損傷區(qū)域周圍及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元生存數(shù)量減少,但海馬DG區(qū)細胞數(shù)量無明顯差異。4.腦損傷后TBI/LD組與Sham/LD組相比,海馬DG區(qū)Ki-67陽性細胞數(shù)量增加,同時Brdu標記新生細胞存活數(shù)量也增加(P0.05);TBI/LL組海馬DG區(qū)Ki-67陽性細胞數(shù)量及Brdu標記新生細胞存活數(shù)量較Sham/LD組和TBI/LD組明顯減少(P0.05)。5.用DCX陽性細胞標記未成熟神經(jīng)元,TBI/LD組與Sham/LD組相比,海馬DG區(qū)未成熟神經(jīng)元數(shù)量增加,但TBI/LL組海馬DG區(qū)未成熟神經(jīng)元細胞數(shù)量明顯減少(P0.05)。大鼠腦損傷后伴隨晝夜節(jié)律紊亂將使其體重減輕,神經(jīng)功能損害癥狀加重,平衡運動能力及認知能力受到損害、大鼠腦損傷體積增加,同時腦內(nèi)神經(jīng)元生存數(shù)量及新生神經(jīng)元數(shù)量減少。結論:第二部分晝夜節(jié)律紊亂對NGF治療影響的機制研究目的:探討晝夜節(jié)律紊亂對NGF治療效果的影響及分子機制材料與方法:制備大鼠顱腦損傷模型,采用正常明暗環(huán)境(Light/Dark,LD)和夜晚燈光持續(xù)照射(Light/Light,LL)兩種環(huán)境模式(即正常晝夜節(jié)律與晝夜節(jié)律紊亂),連續(xù)干預14天。實驗大鼠隨機分為3組:正常對照組(Sham/LD)、腦損傷正常節(jié)律加NGF治療組(TBI/LD/NGF)、腦損傷晝夜節(jié)律紊亂加NGF治療組(TBI/LL/NGF)。NGF治療按32ug/kg劑量肌肉注射,連續(xù)注射14天。采用神經(jīng)功能評分觀察大鼠行為學改變;平衡木平衡實驗及行走實驗檢測大鼠運動及平衡能力;水迷宮檢測大鼠學習記憶能力改變;實時定量PCR大鼠腦組織中NGF受體Trk A和p75(NTR)通路相關基因AKT、NTRAK1、NFKβ、BCL-2、BAX、JNK、Caspase-3 m RNA在轉錄水平的相對表達;Westernblot測定NGF受體信號通路Trk A、p75(NTR)、JNK、Caspase-3、AKT、NFKβ、NCo R、PARP蛋白含量;免疫熒光觀察Trk A、p75(NTR)受體表達及星形膠質細胞增殖、小膠質細胞活化情況;TUNEL法檢測腦損傷區(qū)域凋亡細胞數(shù)量;Elisa法檢測炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-β在血清和腦組織中的含量。結果:1.對各組大鼠神經(jīng)功能評分及平衡木實驗結果顯示,TBI/LL/NGF組大鼠神經(jīng)功能損害恢復明顯延遲于TBI/LD/NGF組,損傷后14天時平衡木平衡時間明顯縮短,同時行走時間延長(P0.05)。2.水迷宮試驗中,定位巡航階段,TBI/LL/NGF組由于晝夜節(jié)律紊亂,潛伏期延長,學習能力低于TBI/LD/NGF組(P0.05);在空間探索階段,TBI/LD/NGF組空間探索時間及穿越平臺次數(shù)明顯多于TBI/LL/NGF組(P0.05)。3.實時定量PCR顯示TBI/LD/NGF組在晝夜節(jié)律正常情況下NGF高親和力受體Trk A、及細胞生長、分化相關基因AKT、NTRAK1、NFKβ、BCL-2表達增高,低親和力p75及凋亡相關基因BAX、JNK、Caspase-3表達降低;相反在晝夜節(jié)律紊亂條件下Trk A、AKT、NTRAK1、NFKβ、BCL-2表達降低,p75及凋亡相關基因BAX、JNK、Caspase-3表達呈增高趨勢。同時Westernblot結果也與m RNA表達相一致。4.免疫熒光發(fā)現(xiàn)在TBI/LD/NGF組Trk A受體陽性細胞明顯多于TBI/LL/NGF組(P0.05),但是p75(NTR)陽性細胞少于TBI/LL/NGF組(P0.05)。TUNEL染色顯示TBI/LD/NGF組凋亡細胞數(shù)量明顯少于TBI/LL/NGF組(P0.05)。5.免疫熒光對GFAP陽性星形膠質細胞標記顯示在TBI/LL/NGF組星形膠質細胞反應性增生明顯多于TBI/LD/NGF組(TBI/LL/NGF:466.90±65.10/field VS339.56±48.37/field,P0.05);同時由于晝夜節(jié)律紊亂小膠質細胞活化也呈增多趨勢(TBI/LL/NGF:115.60±23.62/field VS 65.40±12.55/field,P0.05)。6.在血清及腦組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-β分泌TBI/LL/NGF組也明顯高于TBI/LD/NGF組(P0.05)。結論:在晝夜節(jié)律紊亂條件下,NGF對腦損傷治療作用下降。與NGF在正常節(jié)律條件下相比,神經(jīng)功能障礙及認知損害加重、細胞凋亡數(shù)目增多、炎癥因子釋放增加,可能與晝夜節(jié)律紊亂后激活低親和力受體p75介導凋亡信號通路表達有關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R651.15

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