【摘要】：研究背景及意義熱射病(heat strok,HS)是一種死亡率極高的重癥中暑,患者的核心溫度(core temperature,Tc)通常高于40℃,并有中樞神經系統(tǒng)異常,重者常出現(xiàn)全身系統(tǒng)性炎癥(systemic inflammatory response Syndrome,SIRS)、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)等嚴重并發(fā)癥。中樞神經損害是熱射病主要臨床特征,多表現(xiàn)為認知功能減退、共濟失調、澹妄、驚厥、昏迷等。由于熱射病腦損傷因發(fā)生時間早且危害大,已成為熱射病損傷防治關注的焦點。有關熱射病腦損傷的機制,已有研究證明熱刺激可直接損傷腦細胞及其內部結構,誘導神經細胞凋亡或壞死。除了熱應激直接引起中樞神經系統(tǒng)損傷外,近年來有學者提出熱射病腦損傷的發(fā)生可能與中樞神經炎癥相關。熱射病可引起SIRS,全身多個組織臟器發(fā)生嚴重炎癥反應,中樞神經系統(tǒng)觀察到也有炎癥反應發(fā)生,炎癥介質可使細胞功能受損并加速神經元凋亡,使熱射病患者預后欠佳,可發(fā)生認知功能障礙、記憶力減退以及精神失常等。但是熱射病中樞神經炎癥反應究竟是繼發(fā)于外周炎癥反應,還是高熱刺激直接引起中樞神經系統(tǒng)原發(fā)性炎癥反應,目前還缺乏深入研究。而這對于指導臨床救治熱射病,減輕中樞神經損傷具有重要意義。熱射病的高死亡率與病程中發(fā)生MODS相關,中暑的病理生理學機制目前仍未完全清楚闡明,近年來研究發(fā)現(xiàn)熱射病的病理生理過程與內毒素血癥極為相似。熱射病后血清中內毒素濃度升高,可導致單核巨噬細胞及中性粒細胞的活化,分泌TNFα、IL-1β、IL-6等炎癥因子,并呈級聯(lián)放大瀑布效應,促使SIRS的發(fā)生,進而出現(xiàn)MODS,損害多個器官的正常功能。但內毒素是否來源于腸道、腸源性內毒素血癥是否是導致SIRS發(fā)生的主要機理目前仍存在爭論。血腦屏障和腸道屏障是隔絕腦組織、腸道內容物與外周血液的重要結構。正常情況下血腦屏障可阻斷有害的物質通過血液進入腦組織,如果血腦屏障結構破壞,通透性增高,外周血中炎癥介質進入中樞神經系統(tǒng),可引起繼發(fā)性中樞炎癥反應。而腸道屏障則是防止腸道內細菌及其產生的有害物質進入外周血。因此觀察熱射病后血腦屏障及腸道屏障的損傷程度、隨時間的變化規(guī)律以及損傷后對中樞和外周炎癥所產生的影響,對揭示中樞神經系統(tǒng)炎癥、外周炎癥的病理生理機制以及相互關系具有重要作用。因此,本課題旨在通過建立熱射病腦損傷模型,研究熱射病后中樞神經系統(tǒng)炎癥和外周炎癥的變化情況,以及在此過程中血腦屏障及腸道屏障的損傷程度及變化規(guī)律,以揭示中樞神經系統(tǒng)炎癥、外周炎癥的病理生理機制及相互關系,為臨床救治熱射病腦損傷提供新的參考依據(jù)。研究方法1,使用健康BALB/c小鼠,12周齡,雄性,重量(29.1±0.6)g,在(41.2±0.5)℃,濕度(60±2)%中持續(xù)暴露至小鼠直腸溫度(rectaltemperature,Tre)達到(42.4±0.2)℃建立熱射病小鼠模型,Tre表示其核心溫度。小鼠分成正常對照組(CON)、熱射病恢復1 h組(HS-1h)、熱射病恢復6 h組(HS-6h)和熱射病恢復24 h組(HS-24h)。對比觀察各組小鼠在高溫模擬艙中及熱射病后的表現(xiàn),艙室內及出艙后Tre變化和生存率情況,利用HE染色和透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察大腦組織病理變化。2,通過實時定量熒光PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測各組小鼠大腦皮層及海馬TNF-α、IL-1β和IL-6基因及蛋白表達,探討熱射病后各恢復時相點大腦炎癥的變化情況。3,通過ELISA檢測各組小鼠外周血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量,鱟試劑動態(tài)濁度法測定各組小鼠血清中內毒素,探討各恢復時相點血清內毒素與炎癥的相關性;利用qPCR檢測各組小鼠脾臟炎癥因子的表達,系統(tǒng)評價熱射病恢復期的外周炎癥反應。4,通過HE染色和TEM觀察各組小鼠血腦屏障及腸道屏障結構相關的病理變化,伊文思藍(evans blue,EB)含量測定以及免疫印跡試驗(western blot,WB)檢測基質金屬蛋白酶2(matrix metalloprotein,MMP-2)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein,MMP-9)表達,反映小鼠血腦屏障的通透性變化,FITC標記葡聚糖4(FITC-Dextran4,FD4)透過率檢測,反應熱射病后各組小鼠腸道屏障的通透性變化。結果1,在(41.2±0.5)℃、濕度(60±2)%環(huán)境中持續(xù)暴露至小鼠Tre達(42.4±0.2)℃建立了小鼠熱射病模型,并按照熱射病后不同恢復時相點分為CON組、HS-1h組、HS-6h組和HS-24h組;艙內小鼠出現(xiàn)躁動、脫水、澹妄至活動減少甚至昏迷,出艙后HS-1h組小鼠Tre明顯降低,表現(xiàn)為低體溫期,HS-24h組小鼠Tre略高于CON組,表現(xiàn)為發(fā)熱期;HE染色和TEM在熱射病小鼠觀察到細胞周圍水腫、細胞核固縮裂解、內質網紊亂等,表明熱應激導致小鼠中樞神經細胞出現(xiàn)明顯病理變化,熱射病中樞神經損傷小鼠模型成功建立。2,HS-1h組、HS-6h組小鼠大腦皮層和海馬炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的基因表達及蛋白合成明顯增多,與CON組相比較差異明顯(P0.01),HS-24h組小鼠大腦皮層和海馬炎癥因子與CON組無明顯差異(P0.05),提示熱射病恢復期6h內中樞神經系統(tǒng)有明顯炎癥反應,以恢復期1 h最為嚴重,在24 h基本恢復正常水平。3,與CON組比較,HS-1h組、HS-6h組和HS-24h組小鼠外周血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和內毒素濃度明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01),在HS-1h組的炎癥因子和HS-6h組的內毒素濃度最高,之后逐漸下降,但到24 h后仍高于對照(P0.01);熱射病各組小鼠脾臟炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達均高于CON組(P0.01),在恢復1 h達到最高,變化趨勢與外周血清基本一致,結果提示熱射病恢復期24 h內持續(xù)出現(xiàn)明顯的外周炎癥反應。4,HE染色和TEM觀察到了大腦微血管周圍水腫以及血管管腔的壓迫、血管內皮細胞連接不緊密以及腫脹和內皮消失,在小腸粘膜發(fā)現(xiàn)腸絨毛變短、稀疏、絨毛缺失,說明熱射病對小鼠血腦屏障和腸道屏障結構造成了病理損傷;在HS-1h組、HS-6h組小鼠大腦MMP-2、MMP-9蛋白合成顯著增多,與CON組相比差異明顯(P0.01),HS-24h組有所恢復,但仍然高于CON組(P0.01);HS-1h組和HS-6h組小鼠EB在大腦中含量與CON組相比明顯增多(P0.01),HS-24h組仍高于CON組(P0.01),說明熱射病恢復期24 h內小鼠血腦屏障的破壞,透通性增高;HS-1h組、HS-6h組和HS-24h組小鼠血清FD4濃度明顯增加,與CON組比較有統(tǒng)計學意義(P0.01),提示熱射病使小鼠腸道屏障透通性增高且一直持續(xù)至24 h。全文結論1.熱射病后恢復期6 h內中樞神經系統(tǒng)出現(xiàn)明顯的炎癥反應,至24 h基本恢復正常。中樞神經炎癥與熱射病中樞神經損傷密切相關。2.熱射病導致腸道屏障的結構破壞和通透性增加,腸道中內毒素可能通過腸道屏障進入血液循環(huán),致使熱射病后恢復期24 h內均發(fā)生明顯外周炎癥反應。3.熱射病導致血腦屏障的結構破壞和通透性增加,熱射病恢復期6 h內,外周炎癥可能因為血腦屏障通透性增加從而影響中樞炎癥的發(fā)生,但熱射病恢復期24 h,中樞神經炎癥表現(xiàn)為獨立的發(fā)展進程,未受外周炎癥的影響。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R594.12

【參考文獻】

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本文編號：2356858