【摘要】：第一部分細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的小鼠全身系統(tǒng)性炎癥對骨再生的影響 目的：骨折修復(fù)有賴于骨骼系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的密切配合。在諸如某些病理情況如多發(fā)性創(chuàng)傷,糖尿病,風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,肥胖,衰老等某些基礎(chǔ)炎癥水平高于正常的情況均能導(dǎo)致骨再生的速度和質(zhì)量下降。本實(shí)驗(yàn)的目的在于應(yīng)用細(xì)菌脂多糖構(gòu)建一種高基礎(chǔ)炎癥狀態(tài)模型,以探討單純炎癥狀態(tài)下骨折愈合的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制。 方法：對10周大C57BL/6老鼠用三點(diǎn)加壓模型造成非穩(wěn)定性骨折后,連續(xù)7天經(jīng)腹腔注射LPS(3μg/天/老鼠),對照組老鼠注射同等劑量的LPS。分別在骨折的第1天,第3天,第7天,第10天,第14天,第21天心臟采血法收集血漿,并收集骨折側(cè)肢體。用雙抗體夾心ELISA方法檢測血漿中IL-6水平。骨折側(cè)肢體經(jīng)過固定,脫鈣,透明,石蠟包埋后進(jìn)行石蠟切片。間隔10張切片分別行Hall Bryant染色。顯微鏡計(jì)算每張切片上骨痂大小及成分。選取Cab2T3和ADTC5兩種細(xì)胞系分別在不同濃度LPS存在下進(jìn)行成骨化和成軟骨化誘導(dǎo),應(yīng)用茜素紅和阿爾新藍(lán)染色判斷成骨化和成軟骨化程度。 結(jié)果：LPS連續(xù)7天注射后,LPS組老鼠未出現(xiàn)明顯發(fā)熱,體重降低,活動(dòng)減少等癥狀。血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),在骨折后24小時(shí)LPS與PBS對照組血漿內(nèi)IL-6水平達(dá)到峰值,但是LPS組IL-6峰值水平遠(yuǎn)高于PBS對照組。骨折后3天,對照組血漿中炎性因子即恢復(fù)至基礎(chǔ)水平,但是LPS組在7天時(shí)才緩慢恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在骨折后第7天,第10天和第14天,LPS組骨痂大小較對照比明顯減小。新生軟骨和新生骨體積LPS組也顯著小于對照組,但軟骨減少更為明顯。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,LPS能明顯抑制成骨作用和成軟骨化作用。 結(jié)論：通過腹腔注射LPS可以系統(tǒng)性基礎(chǔ)炎癥水平增高,系統(tǒng)性炎癥水平升高能導(dǎo)致局部骨再生減緩,同時(shí)影響骨再生質(zhì)量。 第二部分骨折修復(fù)過程中巨噬細(xì)胞的作用及其表型演變 目的：骨折發(fā)生后,正常機(jī)體能有效募集各種炎性細(xì)胞對組織損傷相關(guān)刺激進(jìn)行應(yīng)答,清除炎癥并啟動(dòng)組織修復(fù)程序。巨噬細(xì)胞作為先天性免疫系統(tǒng)的重要的效應(yīng)細(xì)胞,能發(fā)揮清除壞死組織,吞噬細(xì)胞碎片,提呈抗原等作用。此外,巨噬細(xì)胞能根據(jù)細(xì)胞外微環(huán)境尤其是周圍組織炎癥水平呈現(xiàn)不同的極化狀態(tài),表現(xiàn)不同的生物學(xué)功能。在上皮組織傷口愈合中,巨噬細(xì)胞的極化和功能變化已經(jīng)大量見諸報(bào)道,本研究旨在應(yīng)用Ccr2-/-基因缺陷型老鼠研究巨噬細(xì)胞在骨折愈合過程中的作用以及在骨折過程中的表型的動(dòng)態(tài)改變。 方法：實(shí)驗(yàn)采用10周大小的Ccr2-/-老鼠作為干預(yù)組,年齡與性別相匹配的正常C57BL/6老鼠作為對照組,判斷Ccr2基因在骨折愈合過程中的作用。運(yùn)用Yet40和Yarg兩種YFP熒光標(biāo)記老鼠來判斷骨折愈合不同階段M1和M2的數(shù)量。三點(diǎn)加壓法制造非穩(wěn)定性骨折后,不同時(shí)間點(diǎn)收集骨折側(cè)肢體,經(jīng)過固定,脫鈣,透明,石蠟包埋后進(jìn)行石蠟切片,間隔10張切片分別行Hall Bryant染色,顯微鏡下計(jì)算每張切片上骨痂大小及成分。另選取每10張組織切片行免疫組織化學(xué)染色,計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。骨折后分別于第1,3,5,7,10,14天在顯微鏡下分離骨痂,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后用qPCR方法檢測M1和M2相關(guān)基因。在骨折愈合的第1天和第7天,選取Yet40和Yarg熒光標(biāo)記鼠組織切片做抗YFP染色探討骨折修復(fù)過程中巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。 結(jié)果：骨折后第3天,與正常組相比,Ccr2-/-老鼠骨折局部巨噬細(xì)胞明顯減少,但是中性粒細(xì)胞數(shù)量并未出現(xiàn)顯著下降。骨折第7天,Ccr2-/-基因缺陷鼠較野生型老鼠相比,骨折后骨痂大小顯著性減小(P=0.27),新生骨痂中骨含量和軟骨含量兩組之間并無明顯差異。骨折第14天,骨痂大小無明顯差異,對照組新生骨含量明顯多于Ccr2-/-缺陷組。骨折后第21天,Ccr2-/-組骨痂中新生骨體積和軟骨體積均高于對照組。Yet40和Yarg組實(shí)驗(yàn)組提示,骨折后第1天,M1數(shù)量明顯高于M2,至骨折第7天,結(jié)果顯示M1巨噬細(xì)胞數(shù)量減少而M2數(shù)量增多。 結(jié)論：Ccr2基因缺陷老鼠能阻止巨噬細(xì)胞向機(jī)體損傷部位募集從而導(dǎo)致骨折愈合延緩,新生骨數(shù)量和質(zhì)量明顯降低,進(jìn)一步說明巨噬細(xì)胞在骨修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。骨折愈合過程中,巨噬細(xì)胞表型由Ml逐漸向M2表型轉(zhuǎn)變,從促炎癥表型向抗炎癥表型轉(zhuǎn)變,這一轉(zhuǎn)變對清除創(chuàng)傷后局部炎癥,促進(jìn)組織修復(fù)發(fā)揮積極作用。 第三部分年齡相關(guān)性巨噬細(xì)胞極化對成骨細(xì)胞成骨化作用的影響 目的：巨噬細(xì)胞作為一種主要的先天性免疫應(yīng)答細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞在骨折愈合中發(fā)揮重要作用,年齡能影響巨噬細(xì)胞的表型和功能,同時(shí)巨噬細(xì)胞也能根據(jù)細(xì)胞外微環(huán)境的改變而呈現(xiàn)不同的細(xì)胞表型。在組織損傷發(fā)生后,一般認(rèn)為巨噬細(xì)胞首先呈現(xiàn)促炎表型M1,引發(fā)炎癥和機(jī)體免疫應(yīng)答,隨著炎癥的消退,巨噬細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N抗炎表型M2,分泌細(xì)胞外基質(zhì)合成膠原等促進(jìn)組織修復(fù)。本部分研究旨在探討年齡對巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的影響,以及在這種年齡相關(guān)的極化狀態(tài)下,巨噬細(xì)胞與成骨細(xì)胞的相互作用。 方法：不同年齡組老鼠處死后,收集骨髓中單核細(xì)胞。用含有5%CMG12-14細(xì)胞系上清液的a-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)單核細(xì)胞誘導(dǎo)生成小鼠巨噬細(xì)胞。10ng/ml IFN-γ與lOng/ml LPS加入培養(yǎng)基過夜,誘導(dǎo)生成M1型巨噬細(xì)胞,1ng/ml IL-4培養(yǎng)12小時(shí)誘導(dǎo)生成M2型巨噬細(xì)胞。用ELISA方法分別測量細(xì)胞培養(yǎng)上清液中有關(guān)抗炎因子和促炎因子的濃度。用Giess試劑盒測量M1巨噬細(xì)胞上清中的NO含量,用Q-PCR方法檢測M2巨噬細(xì)胞中的YM1和FIZZ1基因的含量,證實(shí)巨噬細(xì)胞已活化為目的表型。分別用三種共培養(yǎng)的方式培養(yǎng)巨噬細(xì)胞和成骨前體細(xì)胞1)標(biāo)準(zhǔn)法混合培養(yǎng)2)條件培養(yǎng)基培養(yǎng)3)Trans-well小室培養(yǎng)。用Q-PCR的方法分別在誘導(dǎo)分化的第3天,第7天,第10天,第14天分別檢查成骨分化的相關(guān)基因ALP, Colla和Osterix表達(dá)情況。在共培養(yǎng)14天后用茜素紅染色和堿性磷酸酶活性檢測的方法來判斷成骨化作用。 結(jié)果：18月組小鼠巨噬細(xì)胞IL-6水平較10周組明顯升高。M1標(biāo)志物NO和M2標(biāo)志物YM1和FIZZ1,18月組均高于10周組。Q-PCR結(jié)果顯示,10周和18周未活化骨髓巨噬細(xì)胞對成骨細(xì)胞成骨化并未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性。對于M1巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下分化的成骨細(xì)胞,早期時(shí)間點(diǎn)成骨化相關(guān)基因表達(dá)水平高于對照,但是晚期時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平低于同年齡組對照。M2條件培養(yǎng)基下,10周組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)成骨化基因均高于正常,而18周M2組與同年齡組對照并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。標(biāo)準(zhǔn)法混合培養(yǎng)體系下,各年齡組茜素紅染色顯示鈣結(jié)節(jié)并無顯著差異。在條件培養(yǎng)基培養(yǎng)和Transwell培養(yǎng)體系下,10周M2組較同年齡M1組相比顯著促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)生成。18月組M1和M2組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量均低于同一年齡正常對照組。 結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)衰老組巨噬細(xì)胞較正常成年組呈現(xiàn)出一種更高的基礎(chǔ)炎性狀態(tài),衰老狀況下巨噬細(xì)胞本身仍然具有向M1和M2極化的能力,并分泌M1,M2特異性標(biāo)記物的能力。這一研究同樣也說明在長期的炎癥環(huán)境下,成骨細(xì)胞成骨作用受損,同時(shí)M2巨噬細(xì)胞表型能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及成骨作用。因此,調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化可能是促進(jìn)如衰老,肥胖,糖尿病等某些長期慢性炎癥情況下骨折修復(fù)再生的關(guān)鍵。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R641

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 管必隆;李維信;;小白鼠肝臟巨噬細(xì)胞的發(fā)生和分化[J];解剖學(xué)報(bào);1965年04期

2 郭畹華;大腦皮質(zhì)神經(jīng)組織體外培養(yǎng)的初步觀察[J];新醫(yī)學(xué);1973年01期

3 王文興;補(bǔ)體系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1974年02期

4 涂洪章;;組織細(xì)胞病[J];國外醫(yī)學(xué).內(nèi)科學(xué)分冊;1974年03期

5 趙玉驊;急性硬化性全腦炎病例(SSPE)時(shí)細(xì)胞免疫功能的研究[J];國際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志;1976年04期

6 夏佩瑩;巨噬細(xì)胞對人惡性細(xì)胞的破壞作用[J];蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1978年S1期

7 馬佳毓;刀豆素A(ConA)對低濃度小鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激——腹腔滲出細(xì)胞的作用[J];國際免疫學(xué)雜志;1983年05期

8 葉文源;自身免疫性溶血性貧血[J];中國醫(yī)師進(jìn)修雜志;1987年06期

9 何成雄;;中毒性表皮壞死松解癥病理中的巨噬細(xì)胞[J];國際皮膚性病學(xué)雜志;1987年01期

10 尚紅生,丁桂鳳,鄧玉蘭,鄧鴻業(yè),龍振州;P388D_1傳代細(xì)胞株產(chǎn)生IL-1效應(yīng)的初步探討[J];中國免疫學(xué)雜志;1988年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 賈俊;白軼;付康;孫志軍;張文峰;趙怡芳;;單核/巨噬細(xì)胞參與血管瘤血管構(gòu)成[A];2007'全國口腔頜面部脈管性疾病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2007年

2 柴嬋娟;楊志明;康玉明;肖傳實(shí);;核因子-κB信號(hào)途徑介導(dǎo)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第11次心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

3 吳南屏;常秀春;姚航平;李丹;馮磊;;RANTES蛋白對SARS病毒感染巨噬細(xì)胞的抑制效應(yīng)及機(jī)制[A];2006年浙江省感染病、肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

4 梁華平;韓健;吳丹;徐祥;王正國;;創(chuàng)傷小鼠腹腔巨噬細(xì)胞自噬活性降低[A];全國危重病急救醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2007年

5 尤勝義;寇麗;費(fèi)乃昕;馬春蕾;;重癥急性胰腺炎大鼠脾臟巨噬細(xì)胞Toll樣受體4的表達(dá)與內(nèi)毒素耐受[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十一屆全國胰腺外科學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2006年

6 劉星光;姚鳴;李楠;王春梅;鄭媛媛;曹雪濤;;鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ通過結(jié)合并活化TAK1和IRF3加強(qiáng)巨噬細(xì)胞中TLR配體誘導(dǎo)的炎癥因子和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生[A];第六屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2008年

7 張偉;周壽紅;凌宏艷;姚起鑫;亓竹青;胡弼;;檳榔堿抑制氧化性低密度脂蛋白刺激巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)及其機(jī)制的初步探討[A];湖南省生理科學(xué)會(huì)2008年度學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2008年

8 陳均法;鄭智茵;孔英;郭艷榮;沈建平;葉寶東;林筱潔;高瑞蘭;周郁鴻;;硼替佐米對THP-1源性巨噬細(xì)胞抗原提呈能力的影響[A];2011年浙江省血液病學(xué)術(shù)年會(huì)暨浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)血液病學(xué)分會(huì)成立50周年慶典論文匯編[C];2011年

9 楊曉彤;任文智;馬偉超;楊明俊;糜可;馮慧琴;楊慶堯;;云芝糖肽(PSP)對小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞的雙向免疫調(diào)節(jié)作用[A];中國菌物學(xué)會(huì)2009學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2009年

10 張玲;江遠(yuǎn);何金洋;郭興伯;;鐵沉積于巨噬細(xì)胞對TGF-β_1、iNOS、TNF-α mRNA表達(dá)的影響[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)全國第十四次肝膽病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 蘭克;以嘗試用巨噬細(xì)胞治癱瘓[N];科技日報(bào);2000年

2 唐穎 倪兵 陳代杰;巨噬細(xì)胞泡沫化抑制劑研究快步進(jìn)行[N];中國醫(yī)藥報(bào);2006年

3 張中橋;白藜蘆醇可抑制巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子[N];中國中醫(yī)藥報(bào);2007年

4 ;以臨床實(shí)驗(yàn)治療癱瘓新法[N];中國醫(yī)藥報(bào);2000年

5 盧蘇燕;艾滋病毒怎樣鉆進(jìn)免疫“肚子”[N];新華每日電訊;2007年

6 侯嘉 何新鄉(xiāng);硒的神奇功能[N];中國食品質(zhì)量報(bào);2003年

7 盧蘇燕;HIV破壞免疫系統(tǒng)機(jī)制被揭示[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2007年

8 李東方;咖喱可預(yù)防早老性癡呆[N];中國中醫(yī)藥報(bào);2007年

9 本報(bào)記者 楊珂;了解我們的體內(nèi)“衛(wèi)士”——免疫系統(tǒng)[N];中國消費(fèi)者報(bào);2001年

10 廣東省農(nóng)科院 黃忠 博士;豬群健康生產(chǎn)要靠什么？[N];中國畜牧獸醫(yī)報(bào);2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 高飛;年齡相關(guān)性巨噬細(xì)胞極化對骨修復(fù)再生作用的研究[D];華中科技大學(xué);2013年

2 章宏;1.人巨噬細(xì)胞金屬彈性蛋白酶在胃癌細(xì)胞及胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義　2.胃癌和結(jié)腸癌患者二氫嘧啶脫氫酶基因多態(tài)性與5-FU代謝及臨床意義探索[D];浙江大學(xué);2006年

3 王玉珍;溶酶體相關(guān)的小G蛋白R(shí)ab7b負(fù)向調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞Toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究[D];浙江大學(xué);2006年

4 楊洋;DcR3干預(yù)肺纖維化動(dòng)物模型及其轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2009年

5 朱繼峰;IL-7抑制巨噬細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2012年

6 羅悅晨;電壓門控型鈉通道中介的單核/巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)在心肌缺血再灌注損傷中的作用[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

7 姚智燕;HCV核心蛋白作用下的巨噬細(xì)胞變化及在肝細(xì)胞增殖中的相互作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

8 顏冬菁;Daintain在巨噬細(xì)胞RAW264.7中的功能研究[D];華中科技大學(xué);2011年

9 馬翠卿;GAS下調(diào)巨噬細(xì)胞炎癥因子的作用及機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

10 鞠瑞;羧胺三唑的抗癌新機(jī)制抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的釋放[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 馮同勝;缺氧對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞生物學(xué)特征的影響[D];蘇州大學(xué);2012年

2 余琦琦;殼寡糖與巨噬細(xì)胞結(jié)合特性的研究[D];浙江大學(xué);2002年

3 馮潔;殼寡糖與巨噬細(xì)胞結(jié)合特性的研究[D];浙江大學(xué);2004年

4 田美玉;復(fù)發(fā)性口腔潰瘍粘膜組織中肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2004年

5 龍飛;糖皮質(zhì)激素對巨噬細(xì)胞快速非基因組作用的研究[D];青島大學(xué);2005年

6 徐啟華;玉屏風(fēng)散轉(zhuǎn)化液對小鼠相關(guān)免疫功能影響的研究[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2005年

7 武多嬌;炎癥細(xì)胞在自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化中的作用及苯那普利的干預(yù)研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2005年

8 徐宗華;胸苷磷酸化酶在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)、分布及臨床意義[D];四川大學(xué);2005年

9 梅智謀;巨噬細(xì)胞與血管內(nèi)皮生長因子在平滑肌腫瘤的表達(dá)及意義[D];武漢大學(xué);2005年

10 楊維娜;子宮內(nèi)膜異位癥中單核—巨噬細(xì)胞分泌白介素-1α、β和干擾素-γ水平的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2006年

，

本文編號(hào)：2333328