【摘要】：目的:膿毒癥(sepsis)是常見(jiàn)的致死原因,其病理過(guò)程常伴隨嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)膿毒癥最常見(jiàn)的致病因素——脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型極化進(jìn)而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)是機(jī)體遭受到外界刺激(內(nèi)毒素,缺氧等)時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生的一個(gè)復(fù)雜的適應(yīng)性反應(yīng),可通過(guò)調(diào)控多條炎癥反應(yīng)通路產(chǎn)生致炎作用。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和巨噬細(xì)胞極化均可控制炎癥反應(yīng)并且二者也有相似的誘發(fā)因素,因此二者是否存在關(guān)聯(lián)是本實(shí)驗(yàn)探究的主要內(nèi)容。方法:第一部分實(shí)驗(yàn)用革蘭陰性菌內(nèi)毒素脂多糖腹腔注射造成炎癥反應(yīng),6h后取小鼠肺組織,用western blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白eIF2α,p-eIF2α,IRE1α,p-IRE1α,p-IκB,XBP-1的表達(dá)量來(lái)判斷膿毒癥所致的炎癥反應(yīng)是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。第二部分實(shí)驗(yàn)將小鼠分為四組,取出其中兩組分別注射內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動(dòng)劑TM和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑TUDCA預(yù)處理30min,然后將處理后的兩組和未處理的一組分別注射等量的LPS,最后一組注射PBS作為對(duì)照。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞M1的標(biāo)記物iNOS的表達(dá)情況來(lái)判斷巨噬細(xì)胞極化是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。第三部分實(shí)驗(yàn)取小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用M-CSF定向誘導(dǎo)至巨噬細(xì)胞M0,然后用LPS刺激使其發(fā)生極化,然后用RT-PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞M1因子IL-1,IL-12,iNOS,TNF-α的表達(dá)水平來(lái)檢測(cè)極化的細(xì)胞是否為M1型。第四部分實(shí)驗(yàn)將定向誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M0分為6組:M-CSF組;LPS組;LPS+TUDCA(50μg/m L)組;LPS+TUDCA(100μg/m L)組;LPS+TUDCA(200μg/mL)組,LPS+TG組。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動(dòng)劑TG和抑制劑TUDCA均需預(yù)處理30min。在體外條件下通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞M1的標(biāo)記物iNOS的表達(dá)情況來(lái)判斷巨噬細(xì)胞極化是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)并且觀察巨噬細(xì)胞極化程度是否與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制程度有關(guān)。結(jié)果:第一部分實(shí)驗(yàn)相較于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白e IF2α,p-e IF2α,p-IRE1α,p-IκB,XBP-1的表達(dá)量均升高。第二部分實(shí)驗(yàn)巨噬細(xì)胞M1的標(biāo)記物iNOS在LPS組表達(dá)高于對(duì)照組(PBS組);相較于LPS組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動(dòng)劑TM預(yù)處理組iNOS表達(dá)量增加,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑TUDCA預(yù)處理組,iNOS表達(dá)量降低。第三部分體外實(shí)驗(yàn)用LPS誘導(dǎo)極化的巨噬細(xì)胞高表達(dá)IL-1,IL-12,iNOS,TNF-α四種巨噬細(xì)胞M1的標(biāo)記物。第四部分實(shí)驗(yàn)巨噬細(xì)胞M1的標(biāo)記物iNOS的表達(dá)量在LPS組,LPS+TUDCA(50μg/m L)組,LPS+TUDCA(100μg/m L)組,LPS+TUDCA(200μg/m L)依次遞減,用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動(dòng)劑TG預(yù)處理組,iNOS表達(dá)量最高。結(jié)論:通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)在LPS所致的膿毒癥模型中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向M1型極化產(chǎn)生致炎作用。
[Abstract]:Objective: sepsis (sepsis) is a common cause of death, and its pathological process is often accompanied by severe inflammatory reaction. Some scholars have found that the most common pathogenic factor of sepsis is lipopolysaccharide (lipopolysaccharide,). LPS) can induce macrophage to M 1 polarization and then produce inflammatory response. Endoplasmic reticulum stress (Endoplasmic reticulum stress,ERS) is a complex adaptive response of endoplasmic reticulum (ER) induced by external stimuli (endotoxin, hypoxia, etc.), which can induce inflammation by regulating multiple inflammatory response pathways. Because endoplasmic reticulum stress and macrophage polarization can both control inflammatory response and have similar inducing factors, the relationship between them is the main content of this experiment. Methods: in the first part of the experiment, inflammatory reaction was induced by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria. Lung tissues were taken from mice 6 hours later. Endoplasmic reticulum stress-related proteins eIF2 偽, p-eIF2 偽, IRE1 偽, p-I 魏 B were detected by western blot. The expression of XBP-1 was used to determine whether the inflammatory response induced by sepsis was related to endoplasmic reticulum stress. In the second part of the experiment, mice were divided into four groups. Two groups were pretreated with endoplasmic reticulum stress agonist (TM) and endoplasmic reticulum stress inhibitor (TUDCA) for 30 min, respectively. Then the treated group and the untreated group were injected with the same amount of LPS, respectively. The last group was given PBS as a control group. The expression of iNOS, a marker of macrophage M1, was detected by flow cytometry to determine whether the polarization of macrophage was related to endoplasmic reticulum stress. In the third part of the experiment, murine bone marrow mesenchymal stem cells were induced to macrophage M0 by M-CSF, then polarized by LPS stimulation, and then detected by RT-PCR for IL-1,IL-12,iNOS, of macrophage M1 factor. The expression level of TNF- 偽 was used to detect whether the polarized cells were M 1 type. In the fourth part of the experiment, we divided the directed macrophage M0 into six groups: M-CSF group, LPS group; LPS TUDCA (50 渭 g / mL group,; LPS TUDCA (100 渭 g / mL group (; LPS TUDCA (200 渭 g/mL group) group. Endoplasmic reticulum stress agonist (TG) and inhibitor TUDCA were pretreated for 30 min. The expression of iNOS, a marker of macrophage M1, was detected by flow cytometry in vitro to determine whether the polarization of macrophage was related to endoplasmic reticulum stress and whether the degree of macrophage polarization was related to the inhibition of endoplasmic reticulum stress. Results: compared with the control group, the expression of ER stress-related proteins e IF2 偽, p-IRE1 偽, p-I 魏 B-1 XBP-1 increased in the experimental group. In the second part, the expression of macrophage M1 marker iNOS in LPS group was higher than that in control group (PBS group). Compared with LPS group, the expression of iNOS was increased in TM preconditioning group, but decreased in TUDCA pretreated with endoplasmic reticulum stress agonist (TUDCA) group. In the third part, LPS was used to induce the overexpression of IL-1,IL-12,iNOS,TNF- 偽 four kinds of macrophages M1 markers. In the fourth part, the expression of iNOS, the marker of macrophage M1, was decreased in the LPS group (, LPS TUDCA (50 渭 g / mL) group (, LPS TUDCA (100 渭 g / mL) group (, LPS TUDCA (200 渭 g / mL) group, and was pretreated with the endoplasmic reticulum stress agonist TG. The expression of iNOS was the highest. Conclusion: in vivo and in vitro experiments demonstrated that endoplasmic reticulum stress induced inflammation by regulating macrophage polarization to M1 type in LPS induced sepsis model.
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R459.7

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本文編號(hào)：2329070