【摘要】：膿毒癥是外來微生物(革蘭陰性細菌)入侵機體后導致系統(tǒng)性免疫功能紊亂,最終導致臟器損傷的感染性疾病總稱。隨著醫(yī)學發(fā)展,膿毒癥的致死率已經(jīng)降至15-25%,但其仍舊是威脅人類健康一個國際性難題,需要全球共同努力攻克。在研究藥物治療膿毒癥方面,一些老藥就成為研究的新寵,研究人員利用已知的藥物庫篩選出可能對脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作用明顯的藥物來治療膿毒癥。我們很榮幸地與約翰霍普金斯大學藥學實驗室合作,通過在已知藥物庫中篩選具有抑制脂多糖經(jīng)典信號通路途徑的藥物,其中一個老藥—甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)具有抑制脂多糖誘導的RAW264.7細胞中TLR-4、IRAK-4、IκB和NF-κB等蛋白的表達作用。在研究甲氨蝶呤抑制脂多糖導致的炎性反應時,甲氨蝶呤表現(xiàn)出明顯的細胞毒性的藥物特性。因此,如何能夠避免或者減弱甲氨蝶呤治療的毒副作用成為本課題研究焦點。甲氨蝶呤作為免疫抑制劑,能夠抑制二氫葉酸還原酶活性影響細胞周期,常用于腫瘤和免疫性疾病治療。甲氨蝶呤作為臨床上最主要的自身免疫性疾病用藥,存在著諸多的不良反應及副作用,如口腔炎、消化道反應、骨髓抑制等。臨床治療中,同時配合口服葉酸能夠一定程度預防甲氨蝶呤誘導的細胞毒性等不良事件。在實驗過程中,我們也發(fā)現(xiàn)低濃度劑量脂多糖可以保護甲氨蝶呤誘導的細胞毒性作用。所以緊接著,我們又發(fā)現(xiàn)低濃度劑量脂多糖保護甲氨蝶呤誘導的細胞毒性作用與細胞凋亡有關,并且深入探索研究發(fā)現(xiàn)這一作用是通過線粒體相關凋亡蛋白P53和Bcl-2家族調(diào)控的而與經(jīng)典的NF-κB關系不緊密。因此,低濃度劑量脂多糖拮抗甲氨蝶呤誘導的細胞毒性作用機制研究,與葉酸解救療法一樣,可以為臨床合理使用甲氨蝶呤減少毒副作用提供靶向干預依據(jù),也為在甲氨蝶呤治療脂多糖導致膿毒癥的治療中如何預防其副作用打開思路。不僅如此,深入研究低劑量脂多糖拮抗甲氨蝶呤誘導的細胞毒性作用,也能夠從不同視角認識脂多糖的基本生理特性,為研究脂多糖相關性疾病提供一定的幫助。第一部分發(fā)現(xiàn)脂多糖對甲氨蝶呤誘導細胞毒性保護作用目的:探尋并證實脂多糖與甲氨蝶呤共刺激RAW264.7巨噬細胞后能夠表現(xiàn)出脂多糖拮抗甲氨蝶呤誘導細胞毒性作用的兩者最佳濃度。方法:(1)甲氨蝶呤對RAW264.7巨噬細胞毒性作用:設立0uM、0.001uM、0.01uM、0.1uM、1uM、10uM甲氨蝶呤藥物濃度刺激RAW264.7巨噬細胞,Alamar Blue法在酶標儀上檢測光密度值后計算各組細胞活性。(2)根據(jù)甲氨蝶呤毒性實驗結(jié)果,實驗設計分為3大組:空白對照組、1um甲氨蝶呤組、10um甲氨蝶呤組,每組都以10倍稀釋成0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml脂多糖分別干預,共刺激24小時,alamarblue法在酶標儀上檢測光密度值后計算各組細胞活性。(3)同此部分(2)實驗分組,共刺激24小時,顯微鏡下大體細胞計數(shù),同時提取蛋白,通過bca法測定各組細胞總蛋白含量。(4)各組數(shù)據(jù)整理后進行相應統(tǒng)計學分析其中差異。結(jié)果:(1)甲氨蝶呤濃度達到0.1um時,細胞毒性開始顯現(xiàn)(p0.01)。(2)在甲氨蝶呤濃度為1um,10um時,10ng/ml和100ng/ml脂多糖能夠一定程度拮抗甲氨蝶呤細胞毒性作用(p0.01)。(3)在甲氨蝶呤濃度為1um,10um時,1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml脂多糖可以一定程度逆轉(zhuǎn)甲氨蝶呤導致的細胞數(shù)量減少和總蛋白含量降低(p0.01)。結(jié)論:10ng/ml和100ng/ml脂多糖能夠一定程度拮抗甲氨蝶呤細胞毒性作用。第二部分脂多糖拮抗甲氨蝶呤細胞毒性與細胞凋亡密切相關目的:驗證細胞凋亡參與調(diào)節(jié)脂多糖拮抗甲氨蝶呤細胞毒性作用。方法:(1)同第一部分(2)實驗分組,各實驗組加入設定濃度的脂多糖和甲氨蝶呤干預24小時,提取蛋白,通過westernblotting的方法檢測各組細胞caspase-3和cleavagecaspase-3蛋白表達差異。(2)根據(jù)前期實驗結(jié)果在6孔板種植巨噬細胞爬片,設立空白對照組、1um甲氨蝶呤組、10um甲氨蝶呤組,給予空白干預和脂多糖(10ng/ml)干預,行tunnel染色檢測細胞凋亡情況,并統(tǒng)計tunnel-positive細胞數(shù)目和百分率。(3)各組數(shù)據(jù)整理后進行相應統(tǒng)計學分析。結(jié)果:(1)甲氨蝶呤可以上調(diào)cleavagecaspase-3蛋白表達,脂多糖可以一定程度逆轉(zhuǎn)cleavagecaspase-3蛋白的上調(diào)(p0.01)。(2)tunnel染色顯示,10ng/ml脂多糖明顯減少甲氨蝶呤誘導的tunnel-positive細胞數(shù)目和百分率(p0.01)。結(jié)論:10ng/ml脂多糖能一定程度逆轉(zhuǎn)甲氨蝶呤細胞毒性作用與細胞凋亡密切相關。第三部分脂多糖對甲氨蝶呤誘導細胞凋亡保護作用與nf-κb蛋白的相關性驗證目的:驗證脂多糖拮抗甲氨蝶呤誘導細胞凋亡作用與脂多糖經(jīng)典通路蛋白nf-κb相關性。方法:同第一部分(2)實驗分組。各實驗組加入設定濃度的脂多糖和甲氨蝶呤干預24小時,提取蛋白,通過westernblotting的方法檢測各組細胞中nf-κb和phosphate-nf-κb的蛋白表達差異;同時檢測上清液中il-6和一氧化氮含量,提取蛋白,通過westernblotting的方法檢測各組一氧化氮合成酶表達差異。結(jié)果:與空白對照組相比,甲氨蝶呤不能影響nf-κb蛋白及一氧化氮合成酶的表達水平,同時脂多糖導致的細胞炎性因子的表達也未被減弱(p0.05)。結(jié)論:脂多糖一定程度逆轉(zhuǎn)甲氨蝶呤細胞毒性作用與NF-κB信號通路無關。第四部分脂多糖通過線粒體相關蛋白P53及Bax/Bcl-2起到保護甲氨蝶呤誘導細胞凋亡作用目的:驗證脂多糖通過線粒體相關凋亡蛋白P53及Bax/Bcl-2拮抗甲氨蝶呤誘導細胞凋亡作用。方法:(1)實驗分為4組:空白對照組(C組)、10ng/ml脂多糖組(L組)、1uM甲氨蝶呤組(M組)、10ng/ml脂多糖和1uM甲氨蝶呤組(LM組)。各實驗組加入不同濃度藥物干預24小時,提取蛋白,采用Western blotting方法檢測各組P53、phosphate-P53和Bax/Bcl-2蛋白表達差異。(2)實驗繼續(xù)分為4組:空白對照組(C組)、P53抑制劑Pifithrin-α組(PF組)、1uM甲氨蝶呤組(M組)、P53抑制劑Pifithrin-α和1uM甲氨蝶呤組(PFM組)。各實驗組按設計給予藥物干預24小時,提取總蛋白,采用Western blottin方法檢測各組P53、caspase-3和cleavage caspase-3蛋白表達差異。(3)同第一部分(2)實驗分組。按本部分實驗設計給予藥物干預24小時,行透射電鏡檢測各組細胞質(zhì)中線粒體變化。結(jié)果:(1)脂多糖通過下調(diào)P53蛋白表達水平拮抗甲氨蝶呤誘導的細胞凋亡,而P53抑制劑Pifithrin-α可以逆轉(zhuǎn)甲氨蝶呤誘導的cleavage caspase-3上調(diào)(p0.01)。(2)脂多糖通過Bax/Bcl-2比率調(diào)節(jié)拮抗甲氨蝶呤誘導的細胞凋亡(p0.01)。(3)透射電鏡顯示,脂多糖可以逆轉(zhuǎn)甲氨蝶呤導致的線粒體損傷。結(jié)論:脂多糖通過線粒體相關蛋白P53及Bax/Bcl-2起到保護甲氨蝶呤誘導細胞凋亡作用。
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【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R459.7

【參考文獻】

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1 陳松;盧利莎;王偉強;薛婷;余娟;孫志娜;趙春曉;廖芳;;脂多糖通過調(diào)控樹突狀細胞存活和分泌細胞因子促進CD4~+T細胞增殖[J];細胞與分子免疫學雜志;2016年09期

2 Li Ding;Xiao-Mao Hu;Hong Wu;Ge-Xiu Liu;Yang-Jun Gao;Dong-Mei He;Yuan Zhang;;Combined transfection of Bcl-2 siRNA and miR-15a oligonucleotides enhanced methotrexate-induced apoptosis in Raji cells[J];Cancer Biology & Medicine;2013年01期

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本文編號：2330194