【摘要】：目的：燒燙傷是日常生活常見的一種創(chuàng)傷,具有高發(fā)病率和死亡率；有報道證實臍帶間質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hucMSC)加速損傷皮膚的創(chuàng)面愈合,然而MSC的保存、運輸及安全性等問題限制了其臨床應用；外泌體(exosome)是hucMSC旁分泌的主要成分,hucMSC-exosome(hucMSC-Ex)在皮膚組織再生中的作用尚未報道。本研究旨在探明hucMSC-Ex促進深Ⅱ度燙傷的修復作用以及闡明exosome促進皮膚再生過程中信號轉導的機制。方法：貼壁法分離培養(yǎng)hucMSC細胞,蔗糖密度梯度離心法分離hucMSC-Ex,通過Western blot分析hucMSC-Ex表面標記CD63CD81和CD9的表達,透射電鏡觀察hucMSC-Ex形態(tài)和大小,Nanosight可視型納米顆粒分析儀檢測hucMSC-Ex的直徑分布情況。80℃熱水燙傷8s制作SD大鼠皮膚深Ⅱ度燙傷模型并應用hucMSC-Ex治療,通過創(chuàng)面大體、HE染色、PCNA和CK19的組織化學染色等方法分析其修復效果；Western blot檢測Bcl-2、Bax表達和流式細胞術Annexin V/PI雙染等技術分析細胞凋亡；細胞計數檢測細胞增殖；劃痕實驗分析細胞的遷移；流式細胞術PI染色分析細胞周期；通過P13K的抑制劑LY294002證明AKT通路在hucMSC-Ex促進皮膚組織再生中的作用；通過β-catenin抑制劑ICG001證明Wnt/β-catenin信號的作用；應用慢病毒載體介導的shRNA干擾hucMSC-Ex及hucMSC中的Wnt4驗證其在深度燙傷修復中作用。應用免疫組化和免疫熒光檢測皮膚組織中CK15、CK19、Integrin a6、CD44、Oct4及Nanog的表達,以標記干細胞的數量；定量RT-PCR檢測皮膚組織中膠原Ⅰ和膠原Ⅲ的表達,Masson染色分析組織中膠原的沉積,皮膚組織和真皮細胞α-SMA的免疫熒光檢測真皮成纖維細胞(DFL)向纖維母細胞的分化；免疫熒光和細胞核質蛋白分離檢測分析β-catenin和YAP在細胞中定位；TopFlash檢測β-catenin的轉錄活性,YAP-TEAD4熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測YAP的轉錄活性；流式細胞術分析CD44在DFL細胞的表達情況；定量RT-PCR分析YAP的靶基因CTGF及Cy61的]mRNA表達；免疫組化檢測p-YAP和YAP在皮膚組織中的表達和定位；將YAP的Ser127和LATS的Thr1079位點突變?yōu)楸彼?以證明此磷酸化位點的功能：液相質譜分析(LC/MS)分析hucMSC-Ex內14-3-3ζ等成分,shRNA敲減14-3-3ζ、α-catenin、YAP、LATS 1/2等分子,腺病毒過表達14-3-3ζ和YAP,以證明它們的功能；通過免疫共沉淀技術(IP)檢測14-3-3ζ、YAP、p-LATS等蛋白間相互作用。結果：成功分離得到hucMSC-Ex,電鏡觀察其形態(tài)為球形,Nanosight分析其直徑為100nm左右,表達CD63、CD81和CD9等標記；成功建立SD大鼠皮膚深ⅡI度燙傷模型,hucMSC-Ex加快深Ⅱ度燙傷皮膚創(chuàng)面愈合,促進皮膚組織細胞的增殖和表皮的再生化,同時促進皮膚組織膠原的合理分布；hucMSC-Ex逆轉熱激損傷引起的細胞凋亡,促進體外細胞擴增；對MAPK通路和AKT通路的篩檢發(fā)現,hucMSC-Ex顯著地的活化AKT信號通路,Luminex檢測發(fā)現hucMSC-Ex中存在包括VEGF等多種可能活化AKT信號的細胞因子；P13K的抑制劑LY294002可以逆轉hucMSC-Ex對細胞凋亡的降低作用,但沒有改變hucMSC-Ex對皮膚細胞周期和細胞遷移的促進作用：進一步研究表明,hucMSC-Ex可以活化Wnt/β-catenin信號,并且β-catenin的抑制劑ICG001逆轉hucMSC-Ex對皮膚損傷的修復作用；將hucMSC-Ex中的Wnt4敲減后(Wnt4-shRNA-Ex),hucMSC-Ex促進皮膚細胞分裂、遷移和加速深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合的作用消失。對exosome治療深Ⅱ度燙傷模型長期觀察可以發(fā)現,hucMSC-Ex對皮膚細胞增殖和β-catenin活化呈現先促進后抑制的現象,同時發(fā)現hucMSC-Ex在修復的后期限制皮膚干細胞的擴增、真皮細胞中α-SMA的表達和膠原ⅢⅢ1的沉積；體外研究發(fā)現,hucMSC-Ex對細胞增殖和β-catenin入核的抑制作用依賴于高細胞密度培養(yǎng)條件,hucMSC-Ex抑制在此培養(yǎng)條件下生長的DFL中a-SMA表達和膠原的沉積;進一步研究發(fā)現,hucMSC-Ex通過促進YAP的磷酸化而誘導YAP的胞質內滯留,hucMSC-Ex對β-catenin抑制作用依賴于YAP Ser127位點的磷酸化；對hucMSC-Ex的液相質譜分析(LC/MS)發(fā)現14-3-3ζ,此蛋白在Hippo通路中有調控作用,hucMSC-Ex中敲減14-3-3ξ的表達逆轉了hucMSC-Ex對YAP Serl27位點磷酸化的促進作用和體外細胞增殖抑制作用,hucMSC-Ex中過表達14-3-3ζ得到相反結果；將細胞中LATS干擾后或者將LATSThr1079位點突變后,14-3-3ζ對YAP磷酸化的促進作用降低；14-3-3ζ、YAP、p-LATS三者可以形成復合物,YAP與其上游激酶p-LATS的結合依賴于14-3-3ζ蛋白；應用14-3-3ζ敲減的hucMSC-Ex(shl4-3-3ζ-Ex)治療深度燙傷模型發(fā)現,sh14-3-3ζ-Ex比對照exosome表現出更強的促增殖能力,修復后皮膚組織表皮層異常增厚、附屬結構較少、纖維母細胞的分化和膠原沉積增多。結論：HucMSC-Ex通過轉運Wnt4活化皮膚的β-catenin信號促進皮膚深Ⅱ燙傷模型的修復；hucMSC-Ex中介導的14-3-3ζ通過加強Hippo-YAP通路協調自身Wnt4信號,預防損傷后皮膚組織過度增生和疤痕形成。
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【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R644

【參考文獻】

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1 ;Human umbilical cord Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells differentiation into nerve-like cells[J];Chinese Medical Journal;2005年23期

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本文編號：2316405