【摘要】：創(chuàng)傷性顱腦損傷（Traumatic brain injury，TBI）后以細(xì)胞凋亡為主要特征的繼發(fā)性腦損害是影響病情轉(zhuǎn)歸的重要因素，但目前具體機(jī)制尚不十分清楚。載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE代表蛋白，APOE代表基因）是腦內(nèi)的主要載脂蛋白，除了脂質(zhì)代謝方面的作用外，具有重要的神經(jīng)生物學(xué)功能。我們課題組及國外研究發(fā)現(xiàn)，APOE基因敲除鼠與野生鼠相比，顱腦損傷后腦組織易損性顯著增加，提示APOE在顱腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但完整的apoE分子量大，正常狀態(tài)下不能通過血腦屏障。COG1410是一種來源于ApoE受體結(jié)合區(qū)的人工合成小分子多肽，克服了apoE全蛋白不能通過血腦屏障的缺點(diǎn)，給予C0G1410可減少腦損傷后小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能評分，從另一方面證實(shí)了ApoE與顱腦損傷的關(guān)系。但APOE影響顱腦損傷病情轉(zhuǎn)歸的機(jī)制尚不十分清楚，有待進(jìn)一步研究。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是繼傳統(tǒng)受體途徑和線粒體途徑后倍受關(guān)注的細(xì)胞凋亡途徑。適度的ERS可通過非折疊蛋白反應(yīng)，增加分子伴侶表達(dá)，以抵抗應(yīng)激，維持細(xì)胞存活；持續(xù)或強(qiáng)烈的應(yīng)激將通過激活其特有的促凋亡途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而在顱腦損傷動物模型和體外實(shí)驗(yàn)研究表明，TBI后ERS水平上升。而在TBI患者，ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否與顱腦損傷有關(guān)尚未見報(bào)道。 同時(shí)，Osada等在腦缺血的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，與WT鼠相比，APOE-/-鼠海馬CA1-CA2區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯增多，且ERS水平上升趨勢更明顯。但是，APOE是否影響TBI后ERS水平？給予外源性擬ApoE短肽是否能抑制ERS發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用？國內(nèi)外尚未見報(bào)道。 因此，本研究通過觀察TBI患者及探討ERS在TBI中的作用及ApoE對TBI后ERS的影響及意義。在TBI患者采用免疫組化法檢測CHOP顱腦創(chuàng)傷周圍組織表達(dá)，并分析其與GCS評分及細(xì)胞凋亡關(guān)系；并進(jìn)一步檢測在APOE敲除鼠及野生鼠（含APOE）小鼠顱腦損傷模型中不同時(shí)間點(diǎn)ERS變化，同時(shí)觀察C0G1410是否能改變TBI后ERS水平，應(yīng)用TUNEL檢測細(xì)胞凋亡，以探討ApoE對TBI后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響及意義，從而為深入闡明ApoE在TBI后的神經(jīng)保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)資料。 一、 CHOP在嚴(yán)重創(chuàng)傷性顱腦損傷患者中的表達(dá)及意義 目的研究CHOP在嚴(yán)重創(chuàng)傷性顱腦損傷（TBI）患者中的表達(dá)，并探討其與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系。方法收集41例TBI患者顱腦創(chuàng)傷周圍組織，并選取因其他疾病(排除TBI及其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病)死亡的尸檢標(biāo)本16例作為對照組。TBI組顱腦損傷傷情程度根據(jù)入院時(shí)GCS評分分為重型TBI（GCS6-8分）組及特重型TBI組（GCS3-5）。采用免疫組化技術(shù)檢測CHOP在顱腦創(chuàng)傷周圍組織的表達(dá)，TUNEL檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并對CHOP表達(dá)水平與凋亡數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)果：與對照組相比，TBI組CHOP的表達(dá)顯著上調(diào)（P0.05）。在TBI組中，特重型TBI組明顯高于重型TBI組（P0.05）。TUNEL檢測結(jié)果表明，TBI組較對照組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加（P0.05），且CHOP表達(dá)水平與凋亡指數(shù)(r=0.72，P0.05)呈正相關(guān)。結(jié)論：TBI后CHOP表達(dá)水平病情嚴(yán)重程度、神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，提示ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑可能在TBI的病理生理過程中起重要作用。 二、顱腦損傷動物模型的建立：控制性皮質(zhì)沖擊損傷模型 目的：建立一個(gè)可靠而穩(wěn)定、重復(fù)性好的顱腦損傷模型。方法：建立小鼠控制性皮質(zhì)沖擊損傷模型。對損傷后小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，并從大體及顯微鏡下觀察各組不同時(shí)間點(diǎn)形態(tài)學(xué)差異，判定顱腦損傷模型是否成功建立。結(jié)果：致傷組同假手術(shù)組及對照組相比，神經(jīng)功能評分增加；形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)致傷組同假手術(shù)組及對照組相比，局部神經(jīng)細(xì)胞凋亡、壞死明顯增加，腦組織水腫、炎細(xì)胞浸潤明顯。結(jié)論：成功建立小鼠皮質(zhì)沖擊顱腦損傷模型，并通過神經(jīng)功能評分及形態(tài)學(xué)觀察進(jìn)一步鑒定，表明所建立的小鼠顱腦損傷模型符合實(shí)驗(yàn)要求，為下一步研究提供模型保障。三、 ApoE對TBI后ERS的影響及意義 目的：在顱腦損傷動物模型中進(jìn)一步研究TBI后ERS水平的改變及APOE對TBI后ERS的影響及意義。方法：將APOE基因敲除鼠及野生鼠各72只隨機(jī)分為假手術(shù)組、致傷組、COG1410干預(yù)致傷組（n=24），即APOE-/-假手術(shù)組、APOE-/-致傷組、APOE-/-致傷+COG1410組；WT假手術(shù)組、WT致傷組、WT致傷+COG1410組。各組按傷后灌注取腦時(shí)間又分為1d、3d、7d三個(gè)亞組（n=8）。Western blot、Real-timePCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記性分子GRP78及CHOP蛋白的表達(dá)，TUNEL檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。再取APOE-/-鼠及WT鼠各27只隨機(jī)分為假手術(shù)組、TBI組、COG1410干預(yù)致傷組，并進(jìn)行神經(jīng)功能評分（mNSS）。 結(jié)果：1.與假手術(shù)組相比，WT致傷組GRP78、CHOP的蛋白及mRNA表達(dá)均明顯上調(diào)，GRP78表達(dá)于傷后1d達(dá)到高峰，而CHOP表達(dá)于傷后3d達(dá)到高峰。WT致傷組傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加(P0.05)，且CHOP表達(dá)量與細(xì)胞凋亡指數(shù)呈正相關(guān)。mNSS評分在各時(shí)間點(diǎn)WT致傷組均高于假手術(shù)組。2.與WT致傷組相比，，APOE-/-致傷組傷后GRP78、CHOP的蛋白及mRNA表達(dá)的上調(diào)趨勢更明顯，且細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增多，mNSS評分增高(均P0.05)。3.給予COG14010后，APOE-/-鼠及WT鼠較各自基因型小鼠致傷組GRP78、CHOP的蛋白及mRNA表達(dá)下降，且細(xì)胞凋亡減少，mNSS評分改善(均P0.05)。結(jié)論：ERS在TBI后被激活，與TBI后繼發(fā)性顱腦損傷密切相關(guān)。敲除APOE基因后，ERS水平增加，細(xì)胞凋亡也增加，同時(shí)神經(jīng)功能損害也更重；而給予外源性擬ApoE短肽COG1410后可抑制TBI后ERS水平，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能評分。表明APOE在顱腦損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用與抑制ERS水平密切相關(guān)，這也為更深入探討ApoE神經(jīng)保護(hù)機(jī)制增加了思路。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R651.15

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2293048