【摘要】：目的從基因和蛋白水平檢測煙霧吸入性損傷后大鼠肺組織Toll樣受體的表達(dá)水平的變化，以及肺泡灌洗液中IL-6和TNF的表達(dá)水平，探討Toll樣受體及下游炎癥因子在煙霧吸入性損傷后肺組織中的表達(dá)和作用。 方法將30只雌雄各半，體重在200g-250g的SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為A、B、C、D、E共5組，每組6只，，A組為空白對照組，B組、C組、D組和E組分別為煙霧吸入后0.5h、2h、4h和6h組。使用自制的煙霧發(fā)生器加熱木屑和煤油的混合物，將大鼠放入致傷室，致傷5min后取出，置于無煙霧的通風(fēng)處5min，再次致傷，共致傷3次，每次5min，致傷完畢后，按照各組時間點(diǎn)用水合氯醛麻醉，解剖大鼠胸腔，采取心臟血、肺泡灌洗液和肺組織。通過以下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：1.通過肺組織大體標(biāo)本觀察比較吸入性損傷后肺的大體變化；2.通過肺組織干濕比（W/D）測定不同時間點(diǎn)各組大鼠肺組織的水腫程度；3.通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測肺組織勻漿中TLR2和TLR4的mRNA表達(dá)水平；4.用免疫印跡（Western blot，WB）檢測TLR2和TLR4蛋白表達(dá)水平；5.經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測定炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)水平；6.通過HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)變化；7.用免疫組織化學(xué)方法檢測TLR2和TLR4蛋白表達(dá)水平。通過相應(yīng)的圖像分析及統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行結(jié)果分析，比較煙霧吸入性損傷后肺組織的大體和組織學(xué)變化，肺組織TLR2和TLR4在mRNA和蛋白水平的表達(dá)水平，以及炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)水平。 結(jié)果（1）.大體觀察煙霧吸入傷后肺體積較正常肺體積略增大，肺表面胸膜下可見大量散在的斑片狀出血，氣管和支氣管內(nèi)有粘液及泡沫狀分泌物，粘膜充血腫脹，剖開肺臟見肺組織充血、腫脹，雙肺可見彌漫性出血點(diǎn)和泡沫狀液體滲出。（2）.肺組織標(biāo)本經(jīng)烘干后用天平稱重，計(jì)算W/D值，結(jié)果顯示煙霧吸入后各時間點(diǎn)肺組織W/D值均高于對照組（P0.05）。其中傷后2h組最高，為5.225±0.263。而傷后各組之間W/D值則無顯著性差異（P0.05）。（3）.經(jīng)PCR檢測煙霧吸入后肺組織TLR2和TLR4mRNA表達(dá)水平，結(jié)果提示煙霧吸入后TLR2在各時間點(diǎn)mRNA水平均高于對照組（P0.05），其中在煙霧吸入后4h肺組織TLR2水平最高，高于煙霧吸入后其他各時間點(diǎn)（P0.05），說明TLR2mRNA水平在煙霧吸入后4h達(dá)高峰，在煙霧吸入6h時開始下降。而傷后0.5h組、2h組和6h組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。TLR4mRNA的變化趨勢為持續(xù)升高，各實(shí)驗(yàn)組均高于對照組（P0.05），其中傷后2h組、4h組和6h組之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），但都較傷后0.5h組明顯升高（P0.05）。（4）.免疫印跡法檢測TLR2和TLR4蛋白表達(dá)水平與PCR結(jié)果基本相符，煙霧吸入后各組TLR2表達(dá)水平均明顯高于對照組（P0.05），煙霧吸入后2h、4h和6h組TLR2蛋白表達(dá)水平比0.5h組高（P0.05），其中煙霧吸入后4h組最高，為37.52±3.29ng/ml，但與2h、6h組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。煙霧吸入后各組TLR4蛋白表達(dá)水平均明顯高于對照組（P0.05），煙霧吸入后6h組TLR4蛋白表達(dá)水平最高，為37.20±3.58ng/ml，與其他各組相比均有顯著性差異（P0.05）。（5）.經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法測定肺泡灌洗液中的炎癥因子IL-6和TNF-α。煙霧吸入性損傷后各時間點(diǎn)肺泡灌洗液中IL-6水平均高于對照組（P0.05）；0.5h組與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05），其中煙霧吸入后4h組IL-6表達(dá)最高，與對照組和0.5h組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。TNF-α在煙霧吸入后持續(xù)升高，煙霧吸入后各時間點(diǎn)TNF-α的表達(dá)均高于對照組（P0.05）。0.5h、2h和4h組TNF-α表達(dá)水平無明顯差異（P0.05），6h組TNF-α表達(dá)水平最高，為6.2±1.4ng/mg，與其他各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。（6）.肺組織HE染色光鏡下顯示0.5h,2h,4h和6h組的肺組織均出現(xiàn)不同程度的炎性浸潤、水腫。其中0.5h組的炎性損傷最輕，4h和6h組的表現(xiàn)較2h組更明顯。（7）.免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)TLR2和TLR4在五個組中均有陽性表達(dá)，傷后各組隨時間持續(xù)升高，整體趨勢與PCR和WB結(jié)果基本相符。染色發(fā)現(xiàn)TLR2和TLR4在細(xì)胞表面和胞漿都有表達(dá)。 結(jié)論1.煙霧吸入性損傷后大鼠肺組織TLR2和TLR4在mRNA和蛋白水平的表達(dá)上調(diào)并參與炎癥反應(yīng)。2.煙霧吸入性損傷后大鼠肺組織的炎癥反應(yīng)隨時間逐漸加重，炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)在傷后早期逐漸升高，與肺組織損傷有相關(guān)性。3. TLR2和TLR4在煙霧吸入性損傷后的表達(dá)水平與炎性因子IL-6和TNF-α的表達(dá)趨勢相符，提示煙霧吸入性損傷的炎癥反應(yīng)有Toll樣受體的信號通路的參與。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R644

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2256474