【摘要】：背景和目的腸上皮屏障可以阻止腸腔內(nèi)的抗原物質(zhì),如細(xì)菌和內(nèi)毒素等進(jìn)入血液循環(huán)。緊密連接(TJ)在細(xì)胞的周圍頂端形成連續(xù)的環(huán)狀結(jié)構(gòu),封閉相鄰細(xì)胞的間隙,是上皮屏障最重要的組成部分,也是維持腸道的屏障功能所必須的。緊密連接破壞導(dǎo)致腸道通透性升高,細(xì)菌產(chǎn)物從腸腔進(jìn)入循環(huán),造成系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)(SIRS)和多器官功能不全(MODS)甚至衰竭3。中暑是一種嚴(yán)重的疾病狀態(tài),其特點(diǎn)是核心體溫升高超過40℃、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害并伴有黏膜結(jié)構(gòu)和功能破壞4。大鼠中暑模型、Caco-2和T84細(xì)胞的熱打擊模型發(fā)現(xiàn),腸屏障功能在中暑的病理進(jìn)程中起重要作用,熱打擊可增加腸道通透性、降低上皮細(xì)胞跨膜電阻(TEER),從而削弱腸屏障的完整性。對動物進(jìn)行熱打擊后觀察到,內(nèi)毒素或脂多糖(LPS)從腸腔經(jīng)過腸上皮進(jìn)入循環(huán)的通過率增加。相反,抗-LPS抗體可保護(hù)機(jī)體,防止從熱損傷狀態(tài)向中暑的病理過程轉(zhuǎn)化。 因此,保護(hù)腸道屏障功能完整是預(yù)防中暑的一個重要方面。n-3多不飽和脂肪酸(n-3 PUFAs)包括二十碳五烯酸(EPA,20：5)和二十二碳六烯酸(DHA,22：6),既往的研究發(fā)現(xiàn),添加n-3 PUFAs可有效對抗炎癥因子導(dǎo)致的腸上皮細(xì)胞通透性增加,包括緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞、TEER下降和對大分子熒光物質(zhì)FITC-dextran (FD4)的濾過增加等腸上皮功能不全情況。此外,n-3 PUFAs可下調(diào)促炎癥因子信號的產(chǎn)生和保護(hù)腸屏障,因而對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病和銀屑病等免疫調(diào)節(jié)紊亂的疾病有益。有證據(jù)顯示,EPA上調(diào)緊密連接蛋白o(hù)ccludin的表達(dá),但花生四烯酸(AA, n-6 PUFA)則下調(diào)其表達(dá)。而且,動物研究也顯示,n-3 PUFAs能降低從腸腔移位到系統(tǒng)循環(huán)的內(nèi)毒素量。盡管有這些發(fā)現(xiàn),n-3 PUFAs對熱打擊后腸道上皮TJ的功能是否有影響仍然不清楚,機(jī)制也未被研究。因此,我們假設(shè),熱打擊前添加n-3PUFAs可以逆轉(zhuǎn)腸上皮通透性的升高和緊密連接蛋白的改變,保護(hù)腸道屏障功能和降低血漿內(nèi)毒素水平,進(jìn)而達(dá)到保護(hù)器官功能、預(yù)防中暑發(fā)生和進(jìn)展的目的。本研究中,我們使用人腸上皮Caco-2單層細(xì)胞作為腸上皮屏障緊密連接的模型,觀察熱打擊后的改變；以及使用大鼠制備中暑模型,研究熱打擊對腸上皮屏障的影響。以此確定n-3 PUFAs酸是否對破壞的腸上皮緊密連接功能具有保護(hù)作用。本研究有以下目的：1、以Caco-2細(xì)胞為腸上皮屏障的體外模型,研究熱打擊對腸上皮緊密連接功能的影響；2、研究不同濃度EPA對熱打擊后腸黏膜屏障的作用,確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳使用劑量；3、研究EPA對熱打擊后腸屏障上皮細(xì)胞間緊密連接的影響,以及作為對照的DHA和AA的作用。詳細(xì)闡明EPA對緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性、以及緊密連接蛋白的表達(dá)及分布變化的影響,從而造成的上皮屏障功能變化。4、建立中暑大鼠模型,觀察中暑大鼠腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞情況；觀察和檢測EPA預(yù)處理后的大鼠緊密連接結(jié)構(gòu)和功能的變化,測定血液中腸黏膜的通透性指標(biāo),證實(shí)EPA對發(fā)生中暑大鼠的腸上皮屏障的緊密連接具有保護(hù)作用。材料和方法主要材料腸上皮細(xì)胞株Caco-2細(xì)胞(ATCC, Manassas, VA),多不飽和脂肪酸和辣根過氧化物酶(Sigma),小鼠抗occludin抗體(BD Biosciences)、兔抗ZO-1抗體(Invitrogen)。Transwell小室(Corning公司)。Trizol及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA)、聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(Roche)、 CCK-8試劑盒(碧云天)、內(nèi)毒素試劑盒(CAMBREX)、D-乳酸試劑盒(Biovision)。方法1.熱打擊對單層腸上皮Caco-2細(xì)胞屏障功能的影響采用人腸上皮細(xì)胞株Caco-2建立腸屏障模型,經(jīng)37～43℃持續(xù)1h的熱打擊后,檢測單層腸上皮細(xì)胞的完整性和通透性,指標(biāo)包括transwell小室內(nèi)的細(xì)胞單層跨膜電阻抗(TEER)值和對大分子物質(zhì)辣根過氧化物酶(HRP)的通透性；采用實(shí)時定量PCR(QRT-PCR)法測定緊密連接蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的mRNA表達(dá)水平,Western blotting檢測它們的蛋白表達(dá)水平。2.二十碳五烯酸影響熱打擊后腸上皮細(xì)胞緊密連接的劑量-效應(yīng)關(guān)系使用人Caco-2細(xì)胞株建立腸上皮細(xì)胞緊密連接模型,分別加入25、50、100、150μM的EPA培養(yǎng)96h后,進(jìn)行43℃的熱打擊。分別使用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖,transwell小室內(nèi)測定單層跨膜電阻抗(TEER)值和對大分子物質(zhì)辣根過氧化物酶(HRP)的通透性,Western blotting檢測occludin蛋白的表達(dá)水平,顯微鏡下觀察考馬斯亮藍(lán)染色細(xì)胞骨架的變化。3.二十碳五烯酸對熱打擊破壞的腸上皮緊密連接的保護(hù)作用人腸上皮細(xì)胞株Caco-2使用50 μM的EPA, DHA或AA預(yù)先孵育96h,進(jìn)行43℃持續(xù)1h的熱打擊。電阻儀測定測定單層跨膜電阻抗(TEER)值,酶標(biāo)儀測定對大分子物質(zhì)辣根過氧化物酶(HRP)的通透性,采用QRT-PCR測定緊密連接蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的mRNA表達(dá)水平,Western blotting檢測蛋白表達(dá)水平,免疫熒光觀察緊密連接蛋白分布,透射電鏡觀察緊密連接的超微結(jié)構(gòu)。4.二十碳五烯酸對中暑大鼠腸上皮緊密連接的作用雄性SD大鼠30只,隨機(jī)分為5組：正常對照組(0.9%生理鹽水1ml/kg)、中暑對照組(0.9%生理鹽水1ml/kg)、EPA預(yù)灌胃組(1g/kg)、DHA預(yù)灌胃組(1g/kg)和玉米油預(yù)灌胃組(1g/kg)。對后4組進(jìn)行溫度為37℃、濕度為60%的高溫處理,制備中暑動物模型。然后,分別測定門靜脈和腹主動脈的血漿內(nèi)毒素水平,腹主動脈血漿的D-乳酸含量,以及離體回腸對HRP的通過率；取回盲部附近的部分回腸及結(jié)腸,行常規(guī)病理檢查和免疫熒光觀察TJ蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的分布；透射電鏡觀察腸上皮細(xì)胞的緊密連接超微結(jié)構(gòu)；刮取腸黏膜使用Western blotting檢測其中的TJ蛋白表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0分析軟件進(jìn)行。多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)作多重比較。配對計(jì)量資料的比較采用配對t檢驗(yàn)。P0.05設(shè)定為差異有顯著性。結(jié)果1溫度升高對單層腸上皮細(xì)胞屏障功能的影響熱打擊時溫度升高明顯降低TEER值,漏入下室中的大分子物質(zhì)HRP逐漸增加,與37℃組相比,兩者在39℃、41℃和43℃組均有顯著性差異(P0.01)。溫度從37℃升高到41℃,緊密連接蛋白o(hù)ccludin的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)逐漸增加,而當(dāng)溫度繼續(xù)上升到43℃,其表達(dá)反而下降。隨溫度升高,ZO-1的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢。43℃熱打擊從1h增加至4h,occludin和ZO-1的蛋白表達(dá)逐漸下降。2不同濃度的EPA對熱打擊后腸上皮細(xì)胞屏障的影響EPA的濃度在0-100μM的范圍內(nèi),都有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用,其中,50μM的EPA促進(jìn)增殖的效果最強(qiáng)(與其他濃度相比,P0.01)。不同濃度的EPA處理24 h-96h,隨時間的延長,各組的TEER值增高,50μ M的EPA處理后效果最明顯,如濃度繼續(xù)增高,則效應(yīng)下降。EPA在0-100μM的范圍內(nèi),均可明顯降低對HRP的通透性,EPA為50μM組通透性升高的幅度最小。50 μ M的EPA對occludin的表達(dá)增加最明顯,對維持細(xì)胞骨架的正常結(jié)構(gòu)有利。因此,選擇50 u M作為EPA的有效劑量較為合理。3多不飽和脂肪酸對熱打擊后腸上皮細(xì)胞緊密連接的影響多不飽和脂肪酸孵育96h并進(jìn)行43℃C持續(xù)1h的熱打擊后,雖然各組的TEER值都下降,但EPA組的值仍然最高(與43℃C組對照組相比,P0.01)。熱打擊可以明顯升高細(xì)胞單層對HRP的通過率,但經(jīng)過EPA預(yù)先孵育的細(xì)胞升高的程度明顯降低(P0.01)。而DHA組和AA組的TEER值和HRP的通過率與對照組相比沒有顯著性差異�！甒estern blot和QRT-PCR的檢測結(jié)果分別顯示,,EPA預(yù)處理可明顯增加TJ蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的mRNA和蛋白表達(dá)(P0.01),DHA可使兩者輕度增加,但AA變化不大。免疫熒光發(fā)現(xiàn),熱打擊后,TJ蛋白o(hù)ccludin、ZO-1在膜上的表達(dá)密度降低,且分布不連續(xù)；EPA預(yù)孵育的細(xì)胞能夠維持其分布的完整性,抑制熱打擊造成的表達(dá)下降,DHA的維持作用稍差,而AA無明顯作用。透射電鏡下觀察TJ超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),熱打擊后,相鄰細(xì)胞間的緊密連接變短、疏松,結(jié)構(gòu)不完整、呈“開放狀態(tài)”；EPA預(yù)處理組細(xì)胞間的緊密連接超微結(jié)構(gòu)較完整、密度下降不明顯、長度變化不大。而DHA組的細(xì)胞緊密連接不連續(xù),但密度較43℃C熱打擊組稍高；AA組只輕微減輕緊密連接長度的改變。4二十碳五烯酸對中暑大鼠腸上皮緊密連接具有保護(hù)作用中暑后腸道通透性指標(biāo)發(fā)生變化。門靜脈和腹主動脈血液的內(nèi)毒素水平結(jié)果均顯示,中暑后各組大鼠內(nèi)毒素水平都明顯升高(與正常對照組相比,P0.01),EPA和DHA處理組均顯著低于中暑對照組(P0.01),但EPA組的數(shù)值與正常對照組更為接近,玉米油組與中暑對照組沒有明顯差異。D乳酸含量的結(jié)果顯示：中暑對照組的D乳酸濃度明顯升高；與中暑對照組相比,EPA和DHA預(yù)處理都使其降低,而玉米油無明顯作用。離體腸對腔內(nèi)大分子物質(zhì)HRP的通透性顯示,中暑后通透性顯著升高,EPA和DHA預(yù)灌胃可明顯減弱其升高程度(P0.01),玉米油組與中暑對照組差別不大。病理結(jié)構(gòu)的變化：中暑后腸黏膜絨毛結(jié)構(gòu)紊亂、上皮細(xì)胞脫落；EPA組的黏膜組織僅見充血及輕度水腫,上皮細(xì)胞排列整齊、脫落較少,絨毛結(jié)構(gòu)較完整；DHA組有較明顯的細(xì)胞脫落現(xiàn)象；玉米油組可見較多上皮細(xì)胞脫落。超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變：中暑后緊密連接分開、呈“開放狀態(tài)”,有的部分?jǐn)嗔?連接疏松,細(xì)胞膜表面的微絨毛斷裂；EPA組細(xì)胞間的緊密連接較完整、密度下降不明顯、長度變化不大；DHA組的結(jié)構(gòu)也較完整、但長度縮短；玉米油組改善不明顯。TJ蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的表達(dá)：熒光顯示,中暑后的蛋白表達(dá)明顯下降,分布不連續(xù),甚至大量缺失；EPA組和DHA組表達(dá)較好,緊密連接蛋白分布較連續(xù)、致密；玉米油組的表達(dá)也下降,可見明顯的脫落現(xiàn)象。Western blot結(jié)果顯示,中暑后緊密連接蛋白的表達(dá)下降,EPA和DHA都可以增加蛋白的表達(dá),EPA的增強(qiáng)作用更為明顯,玉米油與中暑組無明顯差別。結(jié)論1熱打擊可明顯造成腸上皮細(xì)胞間緊密連接的損傷,從而破壞腸屏障功能；2一定劑量范圍內(nèi)的EPA能夠保護(hù)腸上皮緊密連接,對腸黏膜屏障有一定的保護(hù)作用。與其他濃度組相比,濃度為50μM的EPA效果最為明顯；3 EPA對熱打擊造成的腸上皮緊密連接損傷和屏障功能破壞具有保護(hù)作用,而DHA的保護(hù)作用稍差,AA沒有觀察到明顯作用；4 EPA預(yù)防性應(yīng)用能夠改善中暑大鼠腸上皮緊密連接的損傷,減輕內(nèi)毒素血癥,這種保護(hù)作用可能與EPA對腸黏膜緊密連接蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的上調(diào)有關(guān)。DHA也有一定的保護(hù)作用,但較EPA差。玉米油沒有明顯作用。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R594.12

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本文編號：2257022