發(fā)布時間：2018-05-20 23:38

  本文選題：創(chuàng)傷 + 膿毒癥　； 參考：《第三軍醫(yī)大學》2014年博士論文

【摘要】：研究背景 創(chuàng)傷是嚴重危害人類健康的公共衛(wèi)生難題，是45歲以下人群的主要死亡原因。創(chuàng)傷引發(fā)的膿毒癥和多器官功能障礙(MODS)等并發(fā)癥是患者死亡的嚴重威脅。因此，如何盡早甄別出罹患膿毒癥和MODS的高�；颊撸o予及早預防和針對性治療是提高嚴重創(chuàng)傷患者預后的關鍵。臨床和實驗研究表明創(chuàng)傷后機體的免疫應答反應具有個體異質性，創(chuàng)傷膿毒癥和MODS的發(fā)生與機體遺傳背景尤其是單核甘酸多態(tài)性存在密切的內在聯(lián)系，即不同遺傳背景的創(chuàng)傷個體，存在膿毒癥易患性、臨床嚴重程度與預后及治療反應的差異性。因此，從遺傳背景著手深入研究創(chuàng)傷后的炎癥反應規(guī)律、膿毒癥發(fā)生發(fā)展的相關遺傳信息，將為評估和預警創(chuàng)傷膿毒癥的發(fā)生風險性、治療反應或預后建立有效、快捷的分子遺傳學診斷指標和技術。 本研究目的是探索和發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷膿毒癥易患性相關的基因多態(tài)性。首先基于已發(fā)表的膿毒癥遺傳關聯(lián)研究，從循證醫(yī)學角度進行系統(tǒng)評價和meta分析，全面、充分理解膿毒癥發(fā)生的遺傳背景；其次采用候選基因策略選擇一些重要的免疫炎癥調控基因在臨床多中心創(chuàng)傷人群中繼續(xù)探索新的膿毒癥高危基因多態(tài)性位點及其生物學功能，為探索創(chuàng)傷膿毒癥預警診斷方法提供依據(jù)。 材料與方法 1.采用(sepsis OR "septic shock" OR septicemia) AND (polymorphism OR variationOR mutation)關鍵詞在Pubmed、Medline、Embase、Web of Science和HuGE等醫(yī)學文獻數(shù)據(jù)庫中檢索和篩選基因多態(tài)性與膿毒癥發(fā)生風險的遺傳關聯(lián)研究相關文獻，針對≥2個研究人群的基因多態(tài)性位點在顯性模式、隱性模式和等位基因模式下采用meta分析方法評估與膿毒癥發(fā)生風險的關聯(lián)強度，并根據(jù)人群種族進行分層分析。最后采用異質性分析、敏感性分析、發(fā)表偏倚檢驗和威尼斯等級標準評價關聯(lián)結果的可靠性和穩(wěn)定性。 2.從HapMap數(shù)據(jù)庫下載NLRP3、SOCSs和microRNAs全基因及其延伸范圍內的SNP在中國北京漢族人群中的基因型數(shù)據(jù)，采用TAGster軟件計算連鎖不平衡r2值（r2≥0.8）和構建單倍型bin圖譜，從每一個bin內挑選一個能夠代表整個bin內SNP信息的標簽SNP。此外，通過miRNA二級結構構象和靶基因預測分析挑選具有潛在功能性的pre-miRNASNP。 3.在連續(xù)收集的1408例(重慶地區(qū)806例、云南地區(qū)286例、浙江地區(qū)316例)中國漢族嚴重創(chuàng)傷患者中采用焦磷酸測序法進行SNP位點的基因型檢測。計數(shù)各SNP的基因型分布，采用卡方檢驗計算哈溫平衡、顯/隱性遺傳模式下各基因型與膿毒癥發(fā)生率之間的關系，單因素方差分析各基因型與MOD評分的關系，logistic回歸和線性回歸分別分析SNP與創(chuàng)傷后膿毒癥或MOD評分之間的等位基因劑量效應，并進行年齡、性別及ISS等混雜因素的校正。 4.采集創(chuàng)傷后2小時內和健康自愿者外周血，在37℃條件下LPS（100ng/ml）孵育4小時，分離血漿和白細胞。采用ELISA檢測創(chuàng)傷患者血漿中細胞因子的表達水平，采用Real-time PCR檢測LPS刺激的健康自愿者外周血細胞中CIS表達水平 5.通過構建野生型和突變型含有rs2027432-1017G/A、rs414171-237A/T的NLRP3或CIS啟動子的pGL3質粒，轉染人類模式細胞系，采用熒光素酶報告基因系統(tǒng)觀察rs2027432-1017G/A、rs414171-237A/T分別對靶基因NLRP3、CIS啟動子活性影響。相似的，通過構建野生型和突變型的miR-608表達載體、轉染細胞和TaqMan探針法觀察rs4919510G/C對成熟miR-608的表達影響。 結果 1.按照預定的納入標準從8796篇文獻中篩選出232篇膿毒癥遺傳關聯(lián)研究。對56個基因123個多態(tài)性位點的meta分析發(fā)現(xiàn)17個基因21個多態(tài)性位點在不同的遺傳模式下與膿毒癥發(fā)生率密切相關，其中強關聯(lián)位點5個，分別是NOD2rs2066844C/T、LBP rs2232618T/C、TNFA rs361525G/A、IL-10rs1800894、SETPDrs12219080；中等關聯(lián)強度位點6個，分別是TLR1rs5743611G/C、RAGE rs1800625T/C、MD2rs11465996C/G、IL-12B rs2195940、PBEF rs61330082T/C、SFTPD rs1998374。根據(jù)流行病學累計證據(jù)等級劃分沒有基因多態(tài)性位點的證據(jù)等級達到強度，5個位點為中等，，其余位點為微弱等級。通過亞組分析額外發(fā)現(xiàn)IL-10rs1800896在亞洲人群中與膿毒癥發(fā)生風險呈較弱關聯(lián)性，流行病學累計證據(jù)等級為微弱等級。此外，對僅有一組研究數(shù)據(jù)的94個基因177個多態(tài)性位點分析發(fā)現(xiàn)31個基因的42個多態(tài)性位點與膿毒癥發(fā)生風險密切相關，這些關聯(lián)性需要更大研究人群和檢驗功效的研究去證實。 2.基于中國北京漢族人群中的SNP基因型數(shù)據(jù)，通過構建單倍型bin圖譜從35個NLRP3SNPs中挑選6個標簽SNP；采用相同的方法根據(jù)連鎖不平衡強度（r2值）從7個SOCS基因145個SNPs中挑選12個標簽SNP。此外，通過miRNA二級結構和靶基因預測分析從26個pre-miRNA SNPs中挑選9個潛在功能性的SNP。總計在NLRP3、SOCSs和pre-miRNA基因范圍內挑選出27個具有代表性和潛在功能性的SNP。 3.在6個NLRP3標簽SNP中，在重慶創(chuàng)傷人群中兩個SNP（srs2027432-1017G/A、rs12048215+5134A/G)與創(chuàng)傷膿毒癥和MODS的發(fā)生密切相關，顯示A等位基因攜帶者創(chuàng)傷后發(fā)生膿毒癥和MODS的機率明顯增高，LPS誘導的血漿IL-1β表達升高；但兩個SNP并無協(xié)同效應。此外，通過熒光素酶報告實驗也證實-1017A等位基因顯著增強NLRP3啟動子活性。 4.在12個SOCS標簽SNP中，在重慶和浙江創(chuàng)傷人群中CIS基因的rs414171-237A→T和SOCS7rs3748726+49083T→C單獨和協(xié)同地降低創(chuàng)傷后膿毒癥和MODS發(fā)生風險，其中CIS-237T能夠降低血漿促炎細胞因子TNF-α和增加抗炎細胞因子IL-10的表達水平，同時降低LPS誘導的外周血白細胞CIS表達；熒光素酶報告實驗也證實-237T減弱CIS啟動活性。 5.在9個篩選出的潛在功能性miRNA SNPs中。僅有miR-608rs4919510C等位基因在重慶、云南和浙江三個創(chuàng)傷人群中明顯增加創(chuàng)傷后膿毒癥和MODS的發(fā)生，且將三個人群合并后的關聯(lián)強度更大�；蛐�-表型分析發(fā)現(xiàn)rs4919510C顯著降低抗炎細胞因子和增加促炎細胞因子的表達，體外實驗也證實G→C增強成熟miR-608表達水平。 結論 本課題首次針對已發(fā)表的膿毒癥易患性遺傳關聯(lián)研究進行較為系統(tǒng)、全面的meta分析闡明膿毒癥發(fā)生風險的高�；蚨鄳B(tài)性位點。同時通過臨床多中心創(chuàng)傷患者的遺傳關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)NLRP3rs2027432、rs12048215，CIS rs414171，SOCS7rs3748726和miR-608rs4919510等5個新的與創(chuàng)傷后膿毒癥或MODS發(fā)生密切相關的基因多態(tài)性位點。為探尋創(chuàng)傷膿毒癥的分子遺傳學診斷方法，以及開展創(chuàng)傷個體化治療提供了系列有重要臨床價值的遺傳標志物
[Abstract]:Background of the study

Trauma is a public health problem which is seriously harmful to human health . It is the main cause of death of people under 45 years of age . The complications such as sepsis and multiple organ dysfunction syndrome ( MODS ) are the key to the death of patients . Therefore , it is suggested that early prevention and targeted therapy are the key to improve the prognosis of patients with severe trauma .

The purpose of this study was to explore and detect genetic polymorphisms associated with susceptibility to trauma sepsis . First , based on published sepsis genetic association studies , systematic evaluation and meta - analysis were conducted from evidence - based medical perspectives to fully understand the genetic background of sepsis .
Secondly , we use the candidate gene strategy to select some important immune inflammatory regulatory genes to continue to explore new sepsis high - risk gene polymorphism sites and their biological functions in the clinical multi - center wound population , and provide the basis for the exploration of early warning diagnostic methods for wound sepsis .

Materials and Methods

1 . To search and screen genetic association between genetic polymorphism and risk of sepsis in medical literature database such as Pubmed , Medline , Embase , Web of Science and HuGE by using ( sepsis OR " septic shock " OR polymorphism ) and ( polymorphism OR variationOR mutation ) keyword .

2 . The genotype data of NLRP3 , SOCSs and microRNAs in Beijing Han population were downloaded from HapMap database . Using TAGster software to calculate linkage disequilibrium r2 ( r2 鈮

本文編號：1916766