本文選題：創(chuàng)傷性腦損傷 + 神經(jīng)發(fā)生��； 參考：《蘇州大學》2014年博士論文

【摘要】：第一部分成年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后皮質的內源性神經(jīng)發(fā)生 目的： 探討成年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury, TBI）后大腦皮質內源性的神經(jīng)發(fā)生及其影響因素。 方法： Ⅰ、體內實驗 1. SD大鼠分為假手術（SHAM）組和TBI組，SHAM組大鼠只開顱，不制備腦損傷模型；TBI組大鼠采用顱腦液壓損傷裝置，制備創(chuàng)傷性腦損傷模型。 2. SD大鼠TBI后連續(xù)7d腹腔注射BrdU以標記新生的神經(jīng)細胞。 3. TBI后1、3、7、14、28d應用免疫熒光法檢測大鼠損傷區(qū)皮質nestin+/sox-2+神經(jīng)前體細胞（neural progenitor cells, NPCs）、GFAP+/sox-2+放射狀膠質樣細胞、DCX+/BrdU+神經(jīng)元前體細胞、MAP-2+/BrdU+新生神經(jīng)元、NeuN+/BrdU+新生成熟神經(jīng)元、GFAP+/BrdU+新生星形膠質細胞、CNP+/BrdU+新生少突膠質細胞的發(fā)生情況。 4. TBI后1、3、7、14、28d應用TUNEL/BrdU雙標記技術檢測大鼠損傷區(qū)皮質新生細胞的凋亡情況。 5. TBI后1、3、7、14、28d應用ELISA法檢測大鼠損傷區(qū)皮質基質細胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1, SDF-1）的表達水平。 6. TBI后1、3、7、14、28d應用高效液相色譜法（high performance liquidchromatography, HPLC）檢測大鼠腦脊液中谷氨酸含量。 Ⅱ、體外實驗 1.分離培養(yǎng)大鼠TBI后損傷區(qū)皮質內源性NSCs（neural stem cells, NSCs）并進行鑒定，BrdU/Nestin免疫熒光檢測其胚源性及增殖能力，MAP-2、GFAP、CNP免疫熒光檢測其多向分化潛能。 2.傳至第二代的NSCs行谷氨酸受體NMDA主要功能亞基NR1免疫熒光標記，流式細胞分析NR1陽性細胞百分比。 3.傳至第二代的NSCs分空白對照組（Control）、谷氨酸組（Glu）、Glu+MK-801（0h）組、Glu+MK-801（24h）組4組分化培養(yǎng)：Control組用DMEM/F12無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；Glu組在DMEM/F12無血清培養(yǎng)基中加入谷氨酸（5μM）培養(yǎng)；Glu+MK-801(0h)組在DMEM/F12無血清培養(yǎng)基中加入谷氨酸（5μM）培養(yǎng)同時加入NMDA受體拮抗劑MK-801（10μM）；Glu+MK-801（24h）組在DMEM/F12無血清培養(yǎng)基中加入谷氨酸（5μM）培養(yǎng)24h后加MK-801（10μM）繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)1、3、7、14d后行DCX、MAP-2免疫熒光檢測NSCs向神經(jīng)元分化情況，TUNEL法檢測細胞凋亡情況。 4. Control組、Glu+MK-801（24h）組培養(yǎng)1、3、7、14d后，應用實時PCR檢測NR1的mRNA表達情況，Western blot檢測NR1的蛋白表達情況。 5.傳至第二代的NSCs接種于Transwell培養(yǎng)體系的上室，分為空白對照（Control）組、TBI腦組織提取液（Extract）組、SDF-1組3組培養(yǎng)：Control組下室加入DMEM/F12無血清培養(yǎng)基；Extract組下室加入含有20μl/ml TBI腦損傷組織提取液的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基；SDF-1組下室加入含有200ng/ml SDF-1的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)3d后行Hoechst33342染色檢測細胞遷移情況，免疫熒光技術檢測遷移細胞的趨化因子受體4（chemokine receptor4, CXCR4）表達情況。 結果： Ⅰ、體內實驗 1.免疫熒光技術檢測損傷區(qū)皮質神經(jīng)發(fā)生結果：TBI后1、3、7、14d損傷區(qū)周圍皮質出現(xiàn)nestin+/sox-2+NPCs以及GFAP+/sox-2+放射狀膠質樣細胞，并在3d時達到高峰而后下降，在相應時間點GFAP+/sox-2+放射狀膠質樣細胞數(shù)量少于nestin+/sox-2+NPCs。傷后1、3、7d觀察到nestin+/sox-2+NPCs從室周帶后區(qū)（posteriorperiventricular area, PPv）沿胼胝體向損傷區(qū)遷移；傷后3、7、14d損傷區(qū)皮質觀察到DCX+/BrdU+神經(jīng)元前體細胞，7d時達到高峰而后下降；僅在TBI后7、14d損傷區(qū)皮質觀察到少量的MAP-2+/BrdU+新生神經(jīng)元，在TBI后1、3、7、14、28d損傷區(qū)皮質均未觀察到NeuN+/BrdU+新生成熟神經(jīng)元；TBI后1、3、7、14、28d損傷區(qū)皮質均觀察到GFAP+/BrdU+新生星形膠質細胞，7d時達到高峰并一直保持在較高水平；TBI后1、3、7、14、28d損傷區(qū)皮質均未觀察到CNP+/BrdU+新生少突膠質細胞；在相應時間點，BrdU+細胞中星形膠質細胞多于NPCs和新生神經(jīng)元。 2. TUNEL/BrdU雙標記技術檢測新生細胞的凋亡結果：TBI后1、3、7、14d損傷區(qū)周圍皮質出現(xiàn)TUNEL+/BrdU+凋亡的新生細胞，TBI后7、14d時凋亡的新生細胞數(shù)量多于傷后1、3d，高峰在傷后7d，28d時幾乎未見凋亡的新生細胞。 3. ELISA法檢測損傷區(qū)皮質SDF-1的表達水平結果：TBI后1d大鼠損傷區(qū)皮質SDF-1表達開始升高，3d時達到高峰，而后逐漸下降，14、28d時已接近SHAM組水平。 4. HPLC檢測腦脊液谷氨酸含量水平結果：TBI組大鼠腦脊液內谷氨酸的含量傷后1d即達到高峰，而后逐漸下降，14d時已接近SHAM組水平。 Ⅱ、體外實驗 1.成年大鼠TBI后損傷區(qū)皮質內源性NSCs鑒定結果：損傷區(qū)皮質內分離培養(yǎng)出NSCs球為BrdU+/Nestin+，并能擴增傳代，可以分化為MAP-2+神經(jīng)元、GFAP+星形膠質細胞以及CNP+少突膠質細胞。 2.流式細胞分析NSCs的NR1表達結果：成年大鼠TBI后損傷區(qū)皮質內源性NSCs中，43±1.06%細胞的谷氨酸受體NMDA主要功能亞基NR1陽性。 3.谷氨酸對NSCs向神經(jīng)元分化影響結果：培養(yǎng)1d時Glu組、Glu+MK-801（24h）組的DCX+神經(jīng)元前體細胞明顯多于Control、Glu+MK-801（0h）組；3d時Glu+MK-801（24h）組DCX+神經(jīng)元前體細胞最多，Glu組DCX+神經(jīng)元前體細胞數(shù)量有所下降，但多于Control、Glu+MK-801（0h）組；至7d時Glu+MK-801（24h）組DCX+神經(jīng)元前體細胞仍較多，Glu組DCX+神經(jīng)元前體細胞與Control、Glu+MK-801（0h）組比較差異無統(tǒng)計學意義；14d時4組幾乎未見DCX+神經(jīng)元前體細胞，MAP-2免疫熒光檢測顯示Glu+MK-801（24h）組MAP-2+神經(jīng)元明顯多于其它3組；TUNEL法檢測結果顯示，體外培養(yǎng)1d后,4組可見少量凋亡細胞，3、7、14d時Control、Glu+MK-801（0h）、Glu+MK-801（24h）組凋亡細胞數(shù)量與1d時比較幾乎無變化，而Glu組TUNEL+凋亡細胞數(shù)量3d時達到高峰，7d、14d時略有下降但多于其它3組。 4.實時PCR檢測NR1的mRNA表達情況結果：Glu+MK-801(24h)組NR1的mRNA相對表達量呈逐漸升高趨勢，7d時達到高峰，除7、14d外，其它時間點兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義；Control組NR1的mRNA相對表達量較低，各時間點差異無統(tǒng)計學意義；在相應時間點Glu+MK-801（24h）組NR1的mRNA相對表達量均高于Control組，差異均有統(tǒng)計學意義。 5. Western blot檢測NR1的蛋白表達情況結果：Glu+MK-801(24h)組NR1的蛋白相對表達量呈逐漸升高趨勢，7d時達到高峰，除7、14d外，其它時間點兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義；Control組NR1的蛋白相對表達量較低，各時間點差異無統(tǒng)計學意義；在相應時間點Glu+MK-801（24h）組NR1的蛋白相對表達量均高于Control組，差異均有統(tǒng)計學意義。 6. Transwell遷移實驗檢測腦損傷組織提取液及SDF-1對細胞遷移影響的結果：Extract組和SDF-1組遷移的細胞數(shù)量明顯高于Control組，差異有統(tǒng)計學意義；Extract組和SDF-1組遷移的細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義；3組遷移的細胞大部分呈現(xiàn)CXCR4陽性。 結論： 成年SD大鼠TBI后，損傷區(qū)皮質內出現(xiàn)NPCs，其一部分來源于局部激活的放射狀膠質樣細胞，，也有部分從PPv區(qū)沿胼胝體遷移而來，TBI后損傷區(qū)內高表達的SDF-1對其遷移起到了一定的作用；這些NPCs能夠向神經(jīng)元及星形膠質細胞分化，但前者未能最終發(fā)育為成熟的神經(jīng)元，傷后損傷區(qū)內谷氨酸表達水平的增高既可以促進NPCs向神經(jīng)元分化，但也可以促進分化過程中的神經(jīng)元凋亡，后者與神經(jīng)元在發(fā)育過程中NMDA受體表達的逐漸升高有關。 第二部分奧拉西坦對成年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后海馬內源性神經(jīng)發(fā)生的影響 目的： 探討奧拉西坦對成年大鼠TBI后海馬內源性神經(jīng)發(fā)生的影響及其機制。 方法： Ⅰ、體內實驗: 1.經(jīng)水迷宮訓練篩選出達標大鼠，分為空白對照組（Control）、生理鹽水組（NS）、奧拉西坦組（Oxiracetam）3組：Control組只開顱，不制備腦損傷模型；NS組采用顱腦液壓損傷裝置制備TBI模型，TBI后連續(xù)14d定時每天一次尾靜脈注射無菌生理鹽水1ml；Oxiracetam組采用顱腦液壓損傷裝置制備TBI模型，TBI后連續(xù)14d定時每天一次尾靜脈注射含有奧拉西坦（200mg/kg）的無菌生理鹽水1ml。 2. TBI后第15d進行連續(xù)4d的定位巡航試驗，第19d進行空間探索試驗； 3. TBI后第20d應用DCX免疫熒光檢測海馬新生神經(jīng)元情況，ChAT免疫熒光檢測隔區(qū)及Meynert基底核膽堿能神經(jīng)元情況。 4. TBI后第20d應用ATP檢測試劑盒檢測海馬ATP含量。 5. TBI后第20d應用ELISA法檢測海馬乙酰膽堿（acetylcholine, ACh）含量。 Ⅱ、體外實驗： 1.從大鼠胚腦海馬中分離培養(yǎng)NSCs并進行擴增，將傳至第二代的NSCs接種于包被多聚賴氨酸蓋玻片的24孔培養(yǎng)板內，分為空白對照組（Control）、生理鹽水組（NS）、奧拉西坦組（Oxiracetam）3組： Control組加入DMEM/F12無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；NS組加入含有10μl/ml生理鹽水的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；Oxiracetam組加入含有4mg/ml奧拉西坦的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)3d后行DCX免疫熒光檢測NSCs向神經(jīng)元分化情況,并收集細胞應用ATP檢測試劑盒檢測細胞內ATP含量。 2.取大鼠胚基底前腦原基制成單細胞懸液，在Transwell培養(yǎng)體系中分為空白對照組（Control）、膽堿能神經(jīng)元組（Cholinergic neuron）、生理鹽水+膽堿能神經(jīng)元組（NS+Cholinergic neuron）、奧拉西坦+膽堿能神經(jīng)元組（Oxiracetam+Cholinergicneuron）培養(yǎng)： Control組下室不接種鼠胚基底前腦原基制備的單細胞懸液，只加入DMEM/F12無血清培養(yǎng)基；Cholinergic neuron組下室接種鼠胚基底前腦原基制備的單細胞懸液并加入DMEM/F12無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；NS+Cholinergic neuron組下室接種鼠胚基底前腦原基制備的單細胞懸液并加入含10μl/ml生理鹽水的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；Oxiracetam+Cholinergic neuron組下室接種鼠胚基底前腦原基制備的單細胞懸液并加入含有4mg/ml奧拉西坦的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；將從大鼠胚腦海馬中分離擴增的NSCs接種于Transwell培養(yǎng)體系的上室，共培養(yǎng)3d后，行ChAT免疫熒光檢測下室膽堿能神經(jīng)元分化情況、DCX免疫熒光檢測上室海馬NSCs向神經(jīng)元分化情況，收集各組培養(yǎng)液用ELISA法檢測ACh含量。 3.取大鼠胚基底前腦原基制成單細胞懸液，接種于包被多聚賴氨酸蓋玻片的24孔培養(yǎng)板內，分為空白對照組（Control）、生理鹽水+TBI腦組織提取液組（NS+Extract）、奧拉西坦+TBI腦組織提取液組(Oxiracetam+Extract)，開始各組均用DMEM/F12無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。第4d換培養(yǎng)液時，Control組繼續(xù)加入DMEM/F12無血清培養(yǎng)基；NS組加入含有20μl/ml腦損傷皮質提取液、10μl/ml生理鹽水的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基；Oxiracetam+Extract組加入含有20μl/ml腦損傷皮質提取液及4mg/ml奧拉西坦的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基，再培養(yǎng)3d，然后行TUNEL法檢測凋亡細胞。 結果： Ⅰ、體內實驗 1.定位巡航試驗結果：Oxiracetam組和Control組大鼠逃避潛伏期少于NS組，差異有統(tǒng)計學意義。 2.空間探索試驗結果：Oxiracetam組和Control組大鼠平臺跨越次數(shù)高于NS組，差異有統(tǒng)計學意義。 3. DCX免疫熒光檢測海馬齒狀回神經(jīng)元前體細胞結果：Oxiracetam組損傷側齒狀回內DCX+神經(jīng)元前體細胞最多，NS組次之，Control組僅見到少量的DCX+的神經(jīng)元前體細胞，差異有統(tǒng)計學意義。 4. ChAT免疫熒光檢測隔區(qū)及Meynert基底核膽堿能神經(jīng)元結果： Control組可見到較多的ChAT+膽堿能神經(jīng)元，Oxiracetam組損傷側隔區(qū)及Meynert基底核ChAT+膽堿能神經(jīng)元雖有減少但多于NS組，差異有統(tǒng)計學意義。 5.海馬ACh含量檢測結果：Oxiracetam組海馬ACh含量低于Control組，但高于NS組，差異有統(tǒng)計學意義。 6.海馬ATP含量檢測結果：Oxiracetam組海馬ATP含量低于Control組，但高于NS組，差異有統(tǒng)計學意義。 Ⅱ、體外實驗 1. DCX免疫熒光標記檢測奧拉西坦對海馬NSCs向神經(jīng)元分化結果：Control組、NS組、Oxiracetam組均可見少量DCX+神經(jīng)元前體細胞，各組間DCX+神經(jīng)元前體細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義。 2. ATP檢測試劑盒檢測細胞ATP含量結果：Oxiracetam組ATP含量高于Control組和NS組，差異有統(tǒng)計學意義。 3. ChAT免疫熒光檢測膽堿能神經(jīng)元原代培養(yǎng)結果： Cholinergic neuron組、NS+Cholinergic neuron組、Oxiracetam+Cholinergic neuron組均可見較多的ChAT+膽堿能神經(jīng)元，3組間膽堿能神經(jīng)元數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義，Oxiracetam+Cholinergic neuron組ChAT免疫熒光強度較強；Control組未見ChAT+細胞。 4. DCX免疫熒光檢測膽堿能神經(jīng)元對海馬NSCs向神經(jīng)元分化結果：Oxiracetam+Cholinergic neuron組的DCX+神經(jīng)元前體細胞最多，Cholinergic neuron組、NS+Cholinergic neuron組的DCX+神經(jīng)元前體細胞多于Control組，除Cholinergicneuron組和NS+Cholinergic neuron組外，其余兩兩比較均有統(tǒng)計學意義。 5. ELISA法檢測培養(yǎng)液中ACh含量檢測結果： Cholinergic neuron組、NS+Cholinergic neuron組、Oxiracetam+Cholinergic neuron組培養(yǎng)中均能檢測到ACh，Oxiracetam+Cholinergic neuron組培養(yǎng)液中ACh含量高于其它2組；Control組未檢測到ACh。 6. TUNEL試劑盒檢測奧拉西坦對膽堿能神經(jīng)元免于凋亡的保護作用結果：NS+Extract組可見到較多的凋亡細胞，Control組和Oxiracetam+Extract組只見到少量凋亡細胞，3組間凋亡細胞數(shù)量兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義。 結論： 奧拉西坦能夠促進成年大鼠TBI后海馬內源性的神經(jīng)發(fā)生，明顯改善TBI大鼠學習記憶認知功能障礙；奧拉西坦可以保護基底前腦膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)，促進膽堿能神經(jīng)元ACh的分泌從而促進海馬神經(jīng)發(fā)生；此外，奧拉西坦還可以促進海馬細胞ATP的產生，利于神經(jīng)的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R651.15

【共引文獻】

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本文編號：1802363