本文選題：心肌細(xì)胞 + LPS��； 參考：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：內(nèi)毒素休克是臨床常見(jiàn)的全身性危重病癥,死亡率極高。內(nèi)毒素休克患者常伴有心肌炎性損傷和心功能不全,是患者死亡率增加的主要原因。因此防治內(nèi)毒素性心肌功能障礙對(duì)改善內(nèi)毒素血癥患者的預(yù)后具有重要意義。本課題以腺病毒Ad.PrxII為目的基因載體,脂多糖(LPS)為炎癥誘導(dǎo)因子,酶消化法分離得到的成年大鼠心肌細(xì)胞為研究對(duì)象,從NF-κB信號(hào)通路入手,探討LPS刺激后的心肌細(xì)胞炎癥損傷的特征,觀察PrxII過(guò)表達(dá)是否對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌損傷具有保護(hù)作用,并闡明其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:第一部分:腺病毒的擴(kuò)增、純化及其病毒滴度的測(cè)定本部分采用HEK293細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的腺病毒Ad.GFP和Ad.PrxII進(jìn)行擴(kuò)增,然后使用腺病毒純化試劑盒進(jìn)行純化,最后使用綠色熒光蛋白標(biāo)記法對(duì)其進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定,計(jì)算其病毒滴度。第二部分:成年大鼠心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)利用酶消化法分離培養(yǎng)成年大鼠心肌細(xì)胞,并對(duì)分離得到的心肌細(xì)胞采用可視化動(dòng)緣探測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行收縮功能檢測(cè),以確定其是否能夠用于后續(xù)試驗(yàn)。第三部分:PrxII過(guò)表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用首先采用不同濃度的LPS(0,1,5,10μg/ml)處理培養(yǎng)的心肌細(xì)胞24 h,提取蛋白用于Western Blot檢測(cè)PrxII蛋白的表達(dá)變化;然后以200 MOI的感染率加入腺病毒Ad.PrxII感染心肌細(xì)胞,同時(shí)以Ad.GFP作為對(duì)照,培養(yǎng)24 h后,提取蛋白用于免疫印跡檢測(cè)PrxII是否過(guò)表達(dá);最后以200 MOI的感染率加入腺病毒Ad.PrxII感染心肌細(xì)胞,使其在心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá),同時(shí)加入Ad.GFP作為對(duì)照。采用LPS(10μg/ml)構(gòu)建炎癥反應(yīng)模型,同時(shí)采用未加入LPS刺激但轉(zhuǎn)染了腺病毒(Ad.GFP和Ad.PrxII)的心肌細(xì)胞作為對(duì)照,培養(yǎng)24 h,采用MTT法測(cè)定心肌細(xì)胞的活力,提取蛋白用于免疫印跡檢測(cè)蛋白PrxII、Bcl-2、IκBα、p-IκBα和NF-κB的表達(dá)變化,以及NF-κB信號(hào)通路的激活。同時(shí)檢測(cè)培養(yǎng)基中LDH水平的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.腺病毒Ad.GFP和Ad.PrxII的滴度分別為1.8×1011/ml和1.08×1010/ml,均達(dá)到1×1010/ml以上,可以用于后續(xù)試驗(yàn)中。2.可視化動(dòng)緣探測(cè)系統(tǒng)顯示,所分離的心肌細(xì)胞的肌節(jié)縮短分?jǐn)?shù)(FS%)為11.30%±0.94%,最大收縮速率(+dL/dt)為122.36±11.19μm/s,最大舒張速率(-dL/dt)為133.00±12.16μm/s。3.(1)構(gòu)建炎癥反應(yīng)模型所用的LPS的最佳濃度為10μg/ml,LPS刺激后,PrxII蛋白的表達(dá)量下調(diào),并且呈濃度依賴性,表明在應(yīng)激條件下,PrxII表達(dá)下調(diào)參與LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷;(2)MTT法顯示,PrxII可以改善心肌細(xì)胞的活力,對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌功能損傷具有保護(hù)作用;(3)Western Blot顯示,PrxII在心肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá),PrxII對(duì)IκBα的磷酸化具有抑制作用,同時(shí)對(duì)NF-κB的激活具有抑制作用;(4)LDH檢測(cè)顯示,與模型組相比,PrxII過(guò)表達(dá)明顯降低了培養(yǎng)基中的LDH的濃度。結(jié)論:PrxII對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用,可減少LPS刺激產(chǎn)生的炎性因子,有效地改善由此導(dǎo)致的心肌損傷,其機(jī)制可能與PrxII抑制NF-κB信號(hào)通路的激活相關(guān)。
[Abstract]:In order to determine whether PrxII overexpression had protective effect on myocardial injury induced by LPS , it was used to determine whether PrxII overexpression had protective effect on myocardial injury induced by LPS . ( 1 ) The optimal concentration of PrxII was 10 渭g / ml . After LPS stimulation , the expression of PrxII protein was down - regulated .

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R459.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 解彩霞;安亮;魏春華;李曉晶;杜曉紅;李嘉欣;蘇燕;;人紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白與硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶2的相互作用[J];中國(guó)輸血雜志;2015年12期

2 田慈;謝苗榮;;膿毒癥心肌損傷機(jī)制的研究進(jìn)展[J];臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2013年02期

3 王振發(fā);王烈;衛(wèi)立辛;;基因治療病毒載體的研究進(jìn)展[J];福州總醫(yī)院學(xué)報(bào);2009年04期

4 盛志勇,姚詠明;膿毒癥研究的現(xiàn)狀與展望[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;1999年02期

，

本文編號(hào)：1789457