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《山西醫(yī)科大學(xué)》 2015年

血管活性藥物對LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

常麗麗  

【摘要】：目的:研究不同血管活性藥物及同一血管活性藥物的不同劑量對LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響。材料:1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)2主要試劑及藥品:ECM培養(yǎng)基、脂多糖、0.25%胰蛋白酶、生理鹽水、PBS、胎牛血清、去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺、Cell Titer 96#174;AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒、Anne Xin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒。3主要儀器:超凈工作臺、止血鉗、無菌剪、換藥碗、無菌巾、注射器、無菌手套、離心管、離心機(jī)、微量移液器、細(xì)胞培養(yǎng)箱、定時恒溫磁力攪拌器、立式壓力蒸汽滅菌器細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板、倒置相差顯微鏡、全自動酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀。方法:1細(xì)胞培養(yǎng):在無菌條件下取健康產(chǎn)婦正常分娩的新生兒臍帶,找出臍靜脈,淤血完全沖洗之后,注入0.1%II型膠原酶使其充盈,收集充盈液到離心管中離心,將上清液吸棄后加入ECM培養(yǎng)液,吹打制成細(xì)胞懸液,置入培養(yǎng)瓶中,于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2~3天換液一次。3~4天后以1:3進(jìn)行細(xì)胞傳代,待細(xì)胞生長至一定數(shù)量后,取3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。2細(xì)胞生長抑制率的檢測:按照Cell Titer 96#174;AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒說明書操作。3細(xì)胞凋亡的檢測:按照Anne Xin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作。4實(shí)驗(yàn)分組:4.1血管活性藥物對內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制影響的量效關(guān)系:實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為3組(見表A),并選擇每組藥物作用的濃度,采用MTs(四唑類化合物)方法檢測不同濃度實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞生長抑制率。表A分組濃度(μmol/L)NE組0 0.01 0.1 1 10 100DA組0 0.1 1 10 100 1000E組0 0.01 0.1 1 10 1004.2血管活性藥物對LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制影響的量效關(guān)系:4.2.1LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制的量效關(guān)系:用濃度為0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L的脂多糖(LPS)刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,采用MTs方法檢測其細(xì)胞生長抑制率,選取適當(dāng)濃度,建立膿毒癥細(xì)胞損傷的體外模型。4.2.2血管活性藥物對LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制的量效關(guān)系:根據(jù)LPS作用的MTs實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇LPS的作用濃度為10mg/L。細(xì)胞隨機(jī)分為3組(見表B),并選擇每組藥物作用的濃度,采用MTs方法檢測不同濃度實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞生長抑制率。表B分組LPS(10mg/L)1 2 3 4 5 6 7NE組(μmol/L)control 0 0.01 0.1 1 10 100DA組(μmol/L)control 0 0.1 1 10 100 1000E組(μmol/L)control 0 0.01 0.1 1 10 100注:control(對照組)即細(xì)胞不做任何處理4.3血管活性藥物對LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響:實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為3組(見表C),選擇每組藥物作用的濃度,采用流式細(xì)胞技術(shù),測定不同濃度實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率。表C分組LPS(10mg/L)1 2 3 4 5NE組(μmol/L)control 0 0.01 1 100DA組(μmol/L)control 0 0.1 10 1000E組(μmol/L)control 0 0.01 1 100注:control(對照組)即細(xì)胞不做任何處理5數(shù)據(jù)處理:采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用方差分析,組間比較用多個樣本均數(shù)兩兩比較的SNK法。P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1血管活性藥物對內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制影響的量效關(guān)系:小劑量血管活性藥物(NE/E1μmol/L,DA10μmol/L)對HUVEC的影響無顯著變化,隨著藥物濃度增加(1μmol/LNE/E10μmol/L,10μmol/LDA100μmol/L),細(xì)胞生長抑制率逐漸升高,當(dāng)藥物濃度繼續(xù)升高(NE/E10μmol/L,DA100μmol/L)時,細(xì)胞生長抑制率明顯升高,呈濃度依賴性。2血管活性藥物對LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制影響的量效關(guān)系:2.1 LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制的量效關(guān)系:應(yīng)用LPS刺激HUVEC后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長抑制率與LPS濃度成正相關(guān)(r=0.7377,p0.01),從LPS濃度為0.01mg/L時15.67%到LPS濃度為100mg/L時的79.77%,其中,細(xì)胞生長抑制50%左右時的LPS濃度為10mg/L,因此,接下來的實(shí)驗(yàn)選擇此濃度刺激HUVEC建立體外膿毒癥細(xì)胞模型。2.2血管活性藥物對LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制的量效關(guān)系:在12h與24h時,血管活性藥物在一定濃度內(nèi)(NE/E 0.01~1μmol/L,DA 0.1~10μmol/L),隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞生長抑制率降低,當(dāng)藥物濃度增加(1μmol/LNE/E10μmol/L,10μmol/LDA100μmol/L)保護(hù)作用消失,細(xì)胞生長抑制率逐漸升高,當(dāng)藥物濃度繼續(xù)升高(NE/E10μmol/L,DA100μmol/L)時,細(xì)胞生長抑制率明顯升高,即高濃度的血管活性藥物與LPS對細(xì)胞生長抑制呈相加作用。在12h-24h之間,一定濃度的血管活性藥物作用于LPS刺激后的HUVEC,隨時間延長,細(xì)胞生長抑制率升高。因此,接下來細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn)中的藥物濃度選擇根據(jù)NE/E(0.01、1、100μmol/L),DA(0.1、10、1000μmol/L)進(jìn)行分組。3血管活性藥物對LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響:在12h與24h時,血管活性藥物在一定濃度范圍內(nèi)(NE/E 0.01~1μmol/L,DA 0.1~10μmol/L),隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞凋亡率降低;當(dāng)藥物濃度增加(1μmol/LNE/E10μmol/L,10μmol/LDA100μmol/L)保護(hù)作用消失,細(xì)胞凋亡率逐漸升高,當(dāng)藥物濃度繼續(xù)升高(NE/E10μmol/L,DA100μmol/L)時,細(xì)胞凋亡率明顯升高,即高濃度的血管活性藥物與LPS對細(xì)胞凋亡率影響呈相加作用,在12h-24h之間,一定濃度的血管活性藥物作用于LPS刺激后的HUVEC,隨時間延長,細(xì)胞凋亡率升高。與MTS結(jié)果相符。結(jié)論:1小劑量的血管活性藥物對LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。2血管活性藥物逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制與凋亡,在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性。3高劑量血管活性藥物加劇LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制與凋亡,并呈濃度依賴性。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R459.7
【目錄】：

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