本文選題：急性心肌梗死模型　切入點(diǎn)：小型豬　出處：《鄭州大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：急性心肌梗死是在冠狀動(dòng)脈病變的基礎(chǔ)上,發(fā)生冠脈內(nèi)粥樣斑塊破裂引起冠脈急性閉塞并導(dǎo)致前向血流中斷,使相應(yīng)的心肌嚴(yán)重而持久地急性缺血、缺氧導(dǎo)致心肌壞死的臨床綜合征。AMI的治療方法包括藥物治療(冠脈溶栓等)、介入(支架)治療、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等。發(fā)展較快的治療方式對(duì)改善AMI的預(yù)后起到了積極的作用,但AMI仍嚴(yán)重威脅著人類的生命安全,臨床上必須高度重視,緊急處理并尋求最佳治療方法。梗死區(qū)內(nèi)是否有血管迅速生成或殘留的血管是否重新開放與心肌梗死的修復(fù)過程密切相關(guān),心梗后快速建立良好的側(cè)支循環(huán)來改善梗死區(qū)血液供應(yīng),促進(jìn)梗死區(qū)心肌細(xì)胞存活具有非常重要的意義。血管生成是指在原有血管結(jié)構(gòu)上長出新血管的生物學(xué)過程。血管生成是一個(gè)多步驟受到嚴(yán)密調(diào)控的復(fù)雜過程,這些調(diào)控主要通過以VEGF為代表的多種因子在時(shí)間和空間上協(xié)同作用,共同促進(jìn)血管生成的進(jìn)行。近年來,隨著對(duì)AMI梗死區(qū)血管新生和血管生長因子研究的不斷深入,通過調(diào)控梗死區(qū)多種血管生成相關(guān)因子的表達(dá)來刺激缺血區(qū)微血管生成,促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立便成了AMI治療的十分誘人且直觀合理的方法。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是近年發(fā)現(xiàn)的一種長度為18~26核苷酸的單鏈內(nèi)源性非編碼小RNA,其序列高度保守,通過與靶基因序列特異性相互作用,介導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄模板的降解或抑制其翻譯,在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá),從而影響包括發(fā)育、分化、增殖和凋亡等多種生物學(xué)過程。mi RNA表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)足以引起一些特異性的心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展,通過糾正那些異常表達(dá)的mi RNA可以為某些心血管疾病的治療提供新方向。mi R-210是血管內(nèi)皮上的特殊的mi RNA,其靶基因Ephrin-A3是VEGF介導(dǎo)血管新生信號(hào)通路的重要信號(hào)分子,mi R-210在心梗后的血管發(fā)生和維持血管的完整性上起著重要作用。我們推測mi R-210通過靶基因Ephrin A3影響VEGF信號(hào)通路并調(diào)控梗死區(qū)多種血管生成相關(guān)因子的表達(dá),刺激梗死及邊緣區(qū)血管生成,促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的形成。為此,我們擬將穩(wěn)定過表達(dá)mi R-210的慢病毒載體首先體外應(yīng)用于血管內(nèi)皮細(xì)胞,研究其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管形成能力的影響;然后注射入小型豬急性心梗模型梗死及邊緣區(qū),研究其對(duì)心梗小型豬心功能及血管生成的影響,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行評(píng)估和探討,以期望為AMI治療探索一條新途徑。第一部分mi R-210慢病毒載體的構(gòu)建、鑒定及包裝目的通過基因工程技術(shù)將mi R-210前體序列克隆至p LVTHM慢病毒表達(dá)載體,構(gòu)建p LVTHM/mi R-210慢病毒表達(dá)載體,為后續(xù)研究mi R-210對(duì)豬急性心肌梗死血管新生的影響及機(jī)制提供了良好的載體。方法由mi RBase數(shù)據(jù)庫獲得pre-ssc-mi R-210序列,利用聚合酶鏈反應(yīng)從豬基因組中擴(kuò)增mi R-210的前體;將mi R-210前體序列和p LVTHM載體經(jīng)Mlu I和Cla I雙酶切后連接,構(gòu)建p LVTHM/mi R-210重組慢病毒表達(dá)載體。雙酶切和測序鑒定,篩選陽性克隆;以p LVTHM/mi R-210、ps PAX2和p MD2.G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染并包裝HEK-293T細(xì)胞,包裝產(chǎn)生慢病毒并測定滴度。結(jié)果經(jīng)雙酶切鑒定和測序證實(shí),成功構(gòu)建了包含mi R-210的慢病毒表達(dá)載體p LVTHM/mi R-210;倒置熒光顯微鏡下觀察可見包裝細(xì)胞HEK-293T表達(dá)綠色熒光。慢病毒滴度測定結(jié)果顯示病毒滴度符合繼續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。結(jié)論成功構(gòu)建了包含mi R-210的慢病毒表達(dá)載體p LVTHM/mi R-210,成功進(jìn)行病毒包裝,病毒滴度符合實(shí)驗(yàn)要求,為進(jìn)一步深入研究mi R-210對(duì)豬急性心肌梗死血管新生的影響及機(jī)制提供了良好的載體。第二部分p LVTHM/mi R-210體外轉(zhuǎn)染促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及分化作用的研究目的研究p LVTHM/mi R-210載體能否有效感染內(nèi)皮細(xì)胞,以及過表達(dá)mi R-210對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管形成能力的影響。方法p LVTHM/mi R-210慢病毒感染血管內(nèi)皮細(xì)胞,CCK-8實(shí)驗(yàn)測定各組細(xì)胞增殖情況;Transwell小室檢測各組細(xì)胞遷移能力;血管形成實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞血管形成能力;q PCR檢測各組細(xì)胞mi R-210表達(dá)相對(duì)含量;酶聯(lián)免疫吸附法檢測不同組別細(xì)胞上清液中VEGF含量。結(jié)果p LVTHM/mi R-210慢病毒感染血管內(nèi)皮細(xì)胞效率在70%以上,各組細(xì)胞形態(tài)無明顯差別;CCK-8檢測結(jié)果顯示mi R-210組細(xì)胞生長曲線上升較為迅速,增殖速度顯著高于空載體組及對(duì)照組,72h為mi R-210組內(nèi)皮細(xì)胞增殖高峰期;Transwell小室檢測結(jié)果顯示mi R-210組侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著高于空載體組及對(duì)照組;不同組別血管內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel膠中檢測血管形成能力,結(jié)果顯示mi R-210組管狀分枝點(diǎn)數(shù)顯著高于空載體組及對(duì)照組;q PCR檢測結(jié)果顯示mi R-210組血管內(nèi)皮細(xì)胞中mi R-210相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)高于對(duì)照組及空載體組;mi R-210組細(xì)胞上清液中VEGF含量顯著高于空載體組及對(duì)照組。結(jié)論p LVTHM/mi R-210能有效感染內(nèi)皮細(xì)胞。mi R-210促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管形成能力可能與mi R-210促進(jìn)ECs分泌VEGF密切相關(guān)。第三部分小型豬急性心肌梗死模型的建立及評(píng)價(jià)目的結(jié)扎小型豬冠狀動(dòng)脈左前降支(Left Anterior Desending Branch,LAD)建立急性心肌梗死模型,并評(píng)價(jià)其效果。方法選取實(shí)驗(yàn)用小豬8只,常規(guī)全身麻醉,氣管插管,平臥于導(dǎo)管室手術(shù)臺(tái),四肢妥善固定,并同時(shí)給予實(shí)時(shí)心電監(jiān)護(hù)、血壓監(jiān)測,置入經(jīng)食管超聲探頭,連接心臟超聲儀。全身肝素化,經(jīng)股動(dòng)脈穿刺并留置鞘管,先行冠狀動(dòng)脈造影(Coronary Artery Angiography,CAG)證實(shí)其左前降支及其他冠狀動(dòng)脈通暢,無狹窄或閉塞等病變。左前胸局部備皮,開胸,打開心包,顯露冠狀動(dòng)脈左前降支,在第一對(duì)角支遠(yuǎn)端約1.5~2cm處以縫線結(jié)扎左前降支,構(gòu)建急性心肌梗死模型。心電監(jiān)護(hù)及描圖提示多個(gè)導(dǎo)聯(lián)ST段明顯弓背向上抬高,結(jié)扎部位以遠(yuǎn)左室前壁及心尖部顏色變暗、變紫、變白,心尖部室壁運(yùn)動(dòng)明顯減弱或消失,冠狀動(dòng)脈造影顯示左前降支完全梗阻,證明造模成功。止血,關(guān)胸。待豬自主呼吸恢復(fù)后拔除氣管插管。檢測術(shù)前及術(shù)后24h心肌損傷標(biāo)志物CK、CK-MB、c Tn I等。術(shù)后2d開始進(jìn)食,術(shù)后3d內(nèi)給予抗生素。術(shù)后第2周,復(fù)查經(jīng)食管超聲心動(dòng)圖、冠狀動(dòng)脈造影及心肌核素灌注顯像(Emssion Computed Tomography,ECT)檢查;術(shù)后第6周(實(shí)驗(yàn)結(jié)束后),全麻后靜脈注射氯化鉀,處死動(dòng)物,剖出心臟,取出左前降支供應(yīng)區(qū)域的缺血區(qū)及正常區(qū)左心室心肌,行相關(guān)病理學(xué)檢查。結(jié)果8頭小型豬中有6頭存活,成活率75%。冠狀動(dòng)脈左前降支完全結(jié)扎、血流阻斷后,可見心電圖ST段下斜形或弓背狀抬高,持續(xù)0.5h,為急性心肌梗死心電圖表現(xiàn)。前降支結(jié)扎24h后血清心肌酶譜(CK、CK-MB、c Tn I)較術(shù)前顯著增高2倍以上,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);經(jīng)食管超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)示造模后與造模前比較實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心功能明顯降低:EF、FS顯著降低,LVESD、LVEDD、LVEDV等顯著增大,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);冠狀動(dòng)脈造影顯示造模后左前降支血流完全中斷,TIMI血流分級(jí)為0級(jí);ECT示前降支遠(yuǎn)段支配區(qū)域較術(shù)前明顯灌注缺損;術(shù)后病理檢查結(jié)果顯示梗死區(qū)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂、排列不齊,肌細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞核大小不甚規(guī)則,細(xì)胞分界不清楚。結(jié)論利用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法制備小型豬急性心肌梗死模型,心電監(jiān)護(hù)顯示ST段弓背向上抬高持續(xù)0.5h;心肌酶學(xué)CK、CK-MB和c Tn I均增高2倍以上;超聲心動(dòng)圖顯示心功能顯著減低;冠狀動(dòng)脈造影顯示左前降支中遠(yuǎn)段結(jié)扎部位處完全閉塞;心肌ECT示前降支中遠(yuǎn)段供應(yīng)區(qū)域明顯灌注缺損。成功建立了小型豬急性心肌梗死模型。第四部分p LVTHM/mi R-210對(duì)急性心肌梗死血管新生的影響及機(jī)制的研究目的將p LVTHM/mi R-210注射到小型豬心肌梗死及邊緣區(qū),4周后通過經(jīng)食道超聲心動(dòng)圖、冠狀動(dòng)脈造影、心肌核素灌注顯像、梗死區(qū)域新生血管密度及Ephrin-A3與VEGF等相關(guān)指標(biāo)及參數(shù)的觀察,探討mi R-210對(duì)小型豬急性心肌梗死區(qū)血管新生的影響與機(jī)制。方法小型豬開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支2周后,將AMI模型動(dòng)物隨機(jī)分為3組:I.模型組,在左心室前壁梗死及梗死邊緣區(qū)心肌分10點(diǎn)將PBS注射到梗死區(qū)域,每點(diǎn)間隔1cm;II.空載體組,將p LVTHM空載體點(diǎn)狀注射到梗死區(qū)域;III.mi R-210組,將p LVTHM/mi R-210點(diǎn)狀注射到梗死區(qū)域(1X1011virus particles/點(diǎn)),治療后4w復(fù)查經(jīng)食管超聲心動(dòng)圖、冠脈造影及心肌核素灌注顯影,開胸取出心臟進(jìn)行心臟病理改變檢測,留取標(biāo)本熒光顯微鏡下觀察GFP蛋白的表達(dá);酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測血清中ET及VEGF的含量的變化;免疫組化檢測CD31因子特異性內(nèi)皮標(biāo)記,同時(shí)利用RT-PCR及免疫印跡測定各組中Ephrin-A3、VEGF m RNA及蛋白含量。結(jié)果移植4周后,經(jīng)食管超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示mi R-210組心功能均較移植前有明顯改善,各項(xiàng)指標(biāo)均與模型組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),模型組與空載體組無顯著性差異(p0.05);冠脈造影結(jié)果顯示mi R-210組梗死區(qū)有相對(duì)明顯的細(xì)小側(cè)枝形成,mi R-210組TIMI評(píng)級(jí)高于模型組,存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),模型組與空載體組無顯著性差異(p0.05);心肌ECT提示mi R-210組缺損面積百分比均低于模型組及空載體組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),模型組與空載體組無顯著性差異(p0.05);熒光顯微鏡檢查結(jié)果顯示,mi R-210組小型豬心肌梗死區(qū)組織切片可見綠色熒光,模型組無任何熒光;酶免實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示mi R-210組血清中ET-1顯著低于模型組及空載體組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),模型組與空載體組無顯著性差異(p0.05);VEGF含量則顯著增加;CD31染色可見mi R-210組缺血心肌組織的血管新生均明顯增強(qiáng),顯著高于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),模型組與空載體組無顯著性差異(p0.05);RT-PCR及免疫印跡結(jié)果顯示mi R-210組梗死區(qū)組織中Ephrin-A3 m RNA及蛋白顯著低于模型組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),模型組與空載體組無顯著性差異(p0.05);mi R-210組梗死區(qū)組織中VEGF m RNA及蛋白顯著高于模型組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),模型組與空載體組無顯著性差異(p0.05)。結(jié)論將p LVTHM/mi R-210注射入小型豬心肌梗死區(qū),4w后可明顯增加該區(qū)新生血管數(shù)量,促進(jìn)梗死區(qū)血管新生,利于冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)的建立,增加心肌血流量,改善心功能。mi R-210促進(jìn)新生血管形成可能與mi R-210過表達(dá)引起的Ephrin-A3表達(dá)的降低及VEGF表達(dá)增加密切相關(guān)。
[Abstract]:Acute myocardial infarction ( AMI ) is a very attractive and intuitive method for the treatment of acute myocardial infarction . The recombinant lentivirus expression vector pLVTHM / mi R - 210 containing mi R - 210 was successfully constructed . The results showed that the expression of mi R - 210 was significantly higher in mi R - 210 group than in control group and control group . The myocardial enzyme spectrum ( CK , CK - MB , c Tn I ) of the left anterior descending branch was significantly decreased after operation . The myocardial enzyme spectrum ( CK , CK - MB , c Tn I ) increased more than 2 times in the left anterior descending branch . The effect and mechanism of mi R - 210 on angiogenesis in acute myocardial infarction were studied by echocardiography , coronary angiography , myocardial nuclear perfusion imaging , myocardial infarction area neovascularization and Ephrin - A3 . There was no significant difference between the model group and the empty vector group ( p < 0.05 ) . The expression of Ephrin - A3 in the infarct zone was significantly higher than that in the model group ( p < 0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R542.22

【參考文獻(xiàn)】

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2 姜英虹;李英博;趙香琴;陳笛;姜蓉;王莎莉;;人參皂苷Rg_1對(duì)人神經(jīng)干細(xì)胞功能表達(dá)的膜片鉗研究[J];中國中藥雜志;2012年22期

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本文編號(hào)：1719717