本文選題：急性心肌梗死模型　切入點：小型豬　出處：《鄭州大學》2014年博士論文

【摘要】：急性心肌梗死是在冠狀動脈病變的基礎(chǔ)上,發(fā)生冠脈內(nèi)粥樣斑塊破裂引起冠脈急性閉塞并導致前向血流中斷,使相應(yīng)的心肌嚴重而持久地急性缺血、缺氧導致心肌壞死的臨床綜合征。AMI的治療方法包括藥物治療(冠脈溶栓等)、介入(支架)治療、冠狀動脈旁路移植術(shù)等。發(fā)展較快的治療方式對改善AMI的預后起到了積極的作用,但AMI仍嚴重威脅著人類的生命安全,臨床上必須高度重視,緊急處理并尋求最佳治療方法。梗死區(qū)內(nèi)是否有血管迅速生成或殘留的血管是否重新開放與心肌梗死的修復過程密切相關(guān),心梗后快速建立良好的側(cè)支循環(huán)來改善梗死區(qū)血液供應(yīng),促進梗死區(qū)心肌細胞存活具有非常重要的意義。血管生成是指在原有血管結(jié)構(gòu)上長出新血管的生物學過程。血管生成是一個多步驟受到嚴密調(diào)控的復雜過程,這些調(diào)控主要通過以VEGF為代表的多種因子在時間和空間上協(xié)同作用,共同促進血管生成的進行。近年來,隨著對AMI梗死區(qū)血管新生和血管生長因子研究的不斷深入,通過調(diào)控梗死區(qū)多種血管生成相關(guān)因子的表達來刺激缺血區(qū)微血管生成,促進側(cè)支循環(huán)的建立便成了AMI治療的十分誘人且直觀合理的方法。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是近年發(fā)現(xiàn)的一種長度為18~26核苷酸的單鏈內(nèi)源性非編碼小RNA,其序列高度保守,通過與靶基因序列特異性相互作用,介導靶基因轉(zhuǎn)錄模板的降解或抑制其翻譯,在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達,從而影響包括發(fā)育、分化、增殖和凋亡等多種生物學過程。mi RNA表達的上調(diào)或下調(diào)足以引起一些特異性的心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展,通過糾正那些異常表達的mi RNA可以為某些心血管疾病的治療提供新方向。mi R-210是血管內(nèi)皮上的特殊的mi RNA,其靶基因Ephrin-A3是VEGF介導血管新生信號通路的重要信號分子,mi R-210在心梗后的血管發(fā)生和維持血管的完整性上起著重要作用。我們推測mi R-210通過靶基因Ephrin A3影響VEGF信號通路并調(diào)控梗死區(qū)多種血管生成相關(guān)因子的表達,刺激梗死及邊緣區(qū)血管生成,促進側(cè)支循環(huán)的形成。為此,我們擬將穩(wěn)定過表達mi R-210的慢病毒載體首先體外應(yīng)用于血管內(nèi)皮細胞,研究其對內(nèi)皮細胞增殖、遷移及血管形成能力的影響;然后注射入小型豬急性心梗模型梗死及邊緣區(qū),研究其對心梗小型豬心功能及血管生成的影響,并對其作用機制進行評估和探討,以期望為AMI治療探索一條新途徑。第一部分mi R-210慢病毒載體的構(gòu)建、鑒定及包裝目的通過基因工程技術(shù)將mi R-210前體序列克隆至p LVTHM慢病毒表達載體,構(gòu)建p LVTHM/mi R-210慢病毒表達載體,為后續(xù)研究mi R-210對豬急性心肌梗死血管新生的影響及機制提供了良好的載體。方法由mi RBase數(shù)據(jù)庫獲得pre-ssc-mi R-210序列,利用聚合酶鏈反應(yīng)從豬基因組中擴增mi R-210的前體;將mi R-210前體序列和p LVTHM載體經(jīng)Mlu I和Cla I雙酶切后連接,構(gòu)建p LVTHM/mi R-210重組慢病毒表達載體。雙酶切和測序鑒定,篩選陽性克隆;以p LVTHM/mi R-210、ps PAX2和p MD2.G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染并包裝HEK-293T細胞,包裝產(chǎn)生慢病毒并測定滴度。結(jié)果經(jīng)雙酶切鑒定和測序證實,成功構(gòu)建了包含mi R-210的慢病毒表達載體p LVTHM/mi R-210;倒置熒光顯微鏡下觀察可見包裝細胞HEK-293T表達綠色熒光。慢病毒滴度測定結(jié)果顯示病毒滴度符合繼續(xù)實驗要求。結(jié)論成功構(gòu)建了包含mi R-210的慢病毒表達載體p LVTHM/mi R-210,成功進行病毒包裝,病毒滴度符合實驗要求,為進一步深入研究mi R-210對豬急性心肌梗死血管新生的影響及機制提供了良好的載體。第二部分p LVTHM/mi R-210體外轉(zhuǎn)染促血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移及分化作用的研究目的研究p LVTHM/mi R-210載體能否有效感染內(nèi)皮細胞,以及過表達mi R-210對內(nèi)皮細胞增殖、遷移及血管形成能力的影響。方法p LVTHM/mi R-210慢病毒感染血管內(nèi)皮細胞,CCK-8實驗測定各組細胞增殖情況;Transwell小室檢測各組細胞遷移能力;血管形成實驗檢測各組細胞血管形成能力;q PCR檢測各組細胞mi R-210表達相對含量;酶聯(lián)免疫吸附法檢測不同組別細胞上清液中VEGF含量。結(jié)果p LVTHM/mi R-210慢病毒感染血管內(nèi)皮細胞效率在70%以上,各組細胞形態(tài)無明顯差別;CCK-8檢測結(jié)果顯示mi R-210組細胞生長曲線上升較為迅速,增殖速度顯著高于空載體組及對照組,72h為mi R-210組內(nèi)皮細胞增殖高峰期;Transwell小室檢測結(jié)果顯示mi R-210組侵襲細胞數(shù)目顯著高于空載體組及對照組;不同組別血管內(nèi)皮細胞在Matrigel膠中檢測血管形成能力,結(jié)果顯示mi R-210組管狀分枝點數(shù)顯著高于空載體組及對照組;q PCR檢測結(jié)果顯示mi R-210組血管內(nèi)皮細胞中mi R-210相對表達量遠高于對照組及空載體組;mi R-210組細胞上清液中VEGF含量顯著高于空載體組及對照組。結(jié)論p LVTHM/mi R-210能有效感染內(nèi)皮細胞。mi R-210促進血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移及血管形成能力可能與mi R-210促進ECs分泌VEGF密切相關(guān)。第三部分小型豬急性心肌梗死模型的建立及評價目的結(jié)扎小型豬冠狀動脈左前降支(Left Anterior Desending Branch,LAD)建立急性心肌梗死模型,并評價其效果。方法選取實驗用小豬8只,常規(guī)全身麻醉,氣管插管,平臥于導管室手術(shù)臺,四肢妥善固定,并同時給予實時心電監(jiān)護、血壓監(jiān)測,置入經(jīng)食管超聲探頭,連接心臟超聲儀。全身肝素化,經(jīng)股動脈穿刺并留置鞘管,先行冠狀動脈造影(Coronary Artery Angiography,CAG)證實其左前降支及其他冠狀動脈通暢,無狹窄或閉塞等病變。左前胸局部備皮,開胸,打開心包,顯露冠狀動脈左前降支,在第一對角支遠端約1.5~2cm處以縫線結(jié)扎左前降支,構(gòu)建急性心肌梗死模型。心電監(jiān)護及描圖提示多個導聯(lián)ST段明顯弓背向上抬高,結(jié)扎部位以遠左室前壁及心尖部顏色變暗、變紫、變白,心尖部室壁運動明顯減弱或消失,冠狀動脈造影顯示左前降支完全梗阻,證明造模成功。止血,關(guān)胸。待豬自主呼吸恢復后拔除氣管插管。檢測術(shù)前及術(shù)后24h心肌損傷標志物CK、CK-MB、c Tn I等。術(shù)后2d開始進食,術(shù)后3d內(nèi)給予抗生素。術(shù)后第2周,復查經(jīng)食管超聲心動圖、冠狀動脈造影及心肌核素灌注顯像(Emssion Computed Tomography,ECT)檢查;術(shù)后第6周(實驗結(jié)束后),全麻后靜脈注射氯化鉀,處死動物,剖出心臟,取出左前降支供應(yīng)區(qū)域的缺血區(qū)及正常區(qū)左心室心肌,行相關(guān)病理學檢查。結(jié)果8頭小型豬中有6頭存活,成活率75%。冠狀動脈左前降支完全結(jié)扎、血流阻斷后,可見心電圖ST段下斜形或弓背狀抬高,持續(xù)0.5h,為急性心肌梗死心電圖表現(xiàn)。前降支結(jié)扎24h后血清心肌酶譜(CK、CK-MB、c Tn I)較術(shù)前顯著增高2倍以上,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);經(jīng)食管超聲心動圖檢查結(jié)示造模后與造模前比較實驗動物心功能明顯降低:EF、FS顯著降低,LVESD、LVEDD、LVEDV等顯著增大,有統(tǒng)計學意義(p0.05);冠狀動脈造影顯示造模后左前降支血流完全中斷,TIMI血流分級為0級;ECT示前降支遠段支配區(qū)域較術(shù)前明顯灌注缺損;術(shù)后病理檢查結(jié)果顯示梗死區(qū)心肌細胞結(jié)構(gòu)紊亂、排列不齊,肌細胞數(shù)量減少,細胞核大小不甚規(guī)則,細胞分界不清楚。結(jié)論利用冠狀動脈結(jié)扎法制備小型豬急性心肌梗死模型,心電監(jiān)護顯示ST段弓背向上抬高持續(xù)0.5h;心肌酶學CK、CK-MB和c Tn I均增高2倍以上;超聲心動圖顯示心功能顯著減低;冠狀動脈造影顯示左前降支中遠段結(jié)扎部位處完全閉塞;心肌ECT示前降支中遠段供應(yīng)區(qū)域明顯灌注缺損。成功建立了小型豬急性心肌梗死模型。第四部分p LVTHM/mi R-210對急性心肌梗死血管新生的影響及機制的研究目的將p LVTHM/mi R-210注射到小型豬心肌梗死及邊緣區(qū),4周后通過經(jīng)食道超聲心動圖、冠狀動脈造影、心肌核素灌注顯像、梗死區(qū)域新生血管密度及Ephrin-A3與VEGF等相關(guān)指標及參數(shù)的觀察,探討mi R-210對小型豬急性心肌梗死區(qū)血管新生的影響與機制。方法小型豬開胸結(jié)扎冠狀動脈前降支2周后,將AMI模型動物隨機分為3組:I.模型組,在左心室前壁梗死及梗死邊緣區(qū)心肌分10點將PBS注射到梗死區(qū)域,每點間隔1cm;II.空載體組,將p LVTHM空載體點狀注射到梗死區(qū)域;III.mi R-210組,將p LVTHM/mi R-210點狀注射到梗死區(qū)域(1X1011virus particles/點),治療后4w復查經(jīng)食管超聲心動圖、冠脈造影及心肌核素灌注顯影,開胸取出心臟進行心臟病理改變檢測,留取標本熒光顯微鏡下觀察GFP蛋白的表達;酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測血清中ET及VEGF的含量的變化;免疫組化檢測CD31因子特異性內(nèi)皮標記,同時利用RT-PCR及免疫印跡測定各組中Ephrin-A3、VEGF m RNA及蛋白含量。結(jié)果移植4周后,經(jīng)食管超聲心動圖結(jié)果顯示mi R-210組心功能均較移植前有明顯改善,各項指標均與模型組存在統(tǒng)計學差異(p0.05),模型組與空載體組無顯著性差異(p0.05);冠脈造影結(jié)果顯示mi R-210組梗死區(qū)有相對明顯的細小側(cè)枝形成,mi R-210組TIMI評級高于模型組,存在統(tǒng)計學差異(p0.05),模型組與空載體組無顯著性差異(p0.05);心肌ECT提示mi R-210組缺損面積百分比均低于模型組及空載體組,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),模型組與空載體組無顯著性差異(p0.05);熒光顯微鏡檢查結(jié)果顯示,mi R-210組小型豬心肌梗死區(qū)組織切片可見綠色熒光,模型組無任何熒光;酶免實驗結(jié)果顯示mi R-210組血清中ET-1顯著低于模型組及空載體組,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),模型組與空載體組無顯著性差異(p0.05);VEGF含量則顯著增加;CD31染色可見mi R-210組缺血心肌組織的血管新生均明顯增強,顯著高于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05),模型組與空載體組無顯著性差異(p0.05);RT-PCR及免疫印跡結(jié)果顯示mi R-210組梗死區(qū)組織中Ephrin-A3 m RNA及蛋白顯著低于模型組,有統(tǒng)計學意義(p0.05),模型組與空載體組無顯著性差異(p0.05);mi R-210組梗死區(qū)組織中VEGF m RNA及蛋白顯著高于模型組,有統(tǒng)計學意義(p0.05),模型組與空載體組無顯著性差異(p0.05)。結(jié)論將p LVTHM/mi R-210注射入小型豬心肌梗死區(qū),4w后可明顯增加該區(qū)新生血管數(shù)量,促進梗死區(qū)血管新生,利于冠狀動脈側(cè)支循環(huán)的建立,增加心肌血流量,改善心功能。mi R-210促進新生血管形成可能與mi R-210過表達引起的Ephrin-A3表達的降低及VEGF表達增加密切相關(guān)。
[Abstract]:Acute myocardial infarction ( AMI ) is a very attractive and intuitive method for the treatment of acute myocardial infarction . The recombinant lentivirus expression vector pLVTHM / mi R - 210 containing mi R - 210 was successfully constructed . The results showed that the expression of mi R - 210 was significantly higher in mi R - 210 group than in control group and control group . The myocardial enzyme spectrum ( CK , CK - MB , c Tn I ) of the left anterior descending branch was significantly decreased after operation . The myocardial enzyme spectrum ( CK , CK - MB , c Tn I ) increased more than 2 times in the left anterior descending branch . The effect and mechanism of mi R - 210 on angiogenesis in acute myocardial infarction were studied by echocardiography , coronary angiography , myocardial nuclear perfusion imaging , myocardial infarction area neovascularization and Ephrin - A3 . There was no significant difference between the model group and the empty vector group ( p < 0.05 ) . The expression of Ephrin - A3 in the infarct zone was significantly higher than that in the model group ( p < 0.05 ) .

【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R542.22

【參考文獻】

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1 李厚懷,沈振亞,惠杰,李科,鄭琳,焦朋,藤曉梅,朱建中,高偉棟,楊俊華,周炳元;應(yīng)用明膠海綿栓塞法建立豬的心肌梗死模型[J];中華醫(yī)學雜志;2005年09期

2 姜英虹;李英博;趙香琴;陳笛;姜蓉;王莎莉;;人參皂苷Rg_1對人神經(jīng)干細胞功能表達的膜片鉗研究[J];中國中藥雜志;2012年22期

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本文編號：1719717