本文選題：蟲草素　切入點(diǎn)：腦外傷　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景及目的創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI),是指一類由各種外傷導(dǎo)致腦組織嚴(yán)重?fù)p害的疾病,具有高發(fā)生率、高致殘率等特點(diǎn),它的致死率、致殘率居創(chuàng)傷的首位[1]。僅在美國,每年大約有170萬例新病例報告,導(dǎo)致約5%的人死亡,超過40%的人長期殘疾,和有25%的成年人受到影響,無法在TBI后1年返回正常工作[2-4]。而在發(fā)展中國家,隨著社會經(jīng)濟(jì)水平不斷提高,交通工具的普及、建筑的大力發(fā)展、高刺激運(yùn)動的引入等等,使TBI的發(fā)病率呈持續(xù)升高的趨勢。在TBI后可以出現(xiàn)相關(guān)的臨床癥狀,造成廣泛的心理和身體的障礙,包括運(yùn)動障礙、癲癇、人格改變、記憶障礙、感覺障礙等。所以,TBI是一個影響公眾的主要的健康問題。然而,目前仍沒有經(jīng)過FDA批準(zhǔn)的腦外傷的治療,對它的研究迫在眉睫。血腦屏障(Blood brain barrier,BBB)完整性的破壞參與了多種疾病的發(fā)生、發(fā)展,包括缺血、多發(fā)性硬化和神經(jīng)退行性疾病比如AD、帕金森病等[5-8]。通過影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn)人的血腦屏障完整性在TBI后被破壞[9]Alluri等研究也發(fā)現(xiàn)腦外傷可引起B(yǎng)BB的完整性的損失,它可以不再是血管內(nèi)皮和大腦之間完美的保護(hù)屏障,它的功能障礙導(dǎo)致液體、蛋白質(zhì)和免疫細(xì)胞的滲出,從而形成血管源性腦水腫,繼發(fā)一系列的神經(jīng)損傷,甚至留下嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙[10]。因此改善血腦屏障的破壞對于改善TBI的結(jié)局至關(guān)重要。生理狀態(tài)下BBB對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。在血腦屏障的完整結(jié)構(gòu)中,腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞由Occludin、Claudins和JAMS(junction Adhesion molecules)三種跨膜蛋白連接形成,其與緊密連接蛋白中閉鎖小帶蛋白-1(Zonulaoccludens-1,ZO-1)直接或間接結(jié)合,連接到細(xì)胞骨架蛋白,穩(wěn)定整體的連接結(jié)構(gòu)。而liu等研究發(fā)現(xiàn)ZO-1和occludin對血腦屏障很關(guān)鍵[11]。有研究發(fā)現(xiàn)在一個大鼠的寒冷損傷模型中,皮層產(chǎn)生純血管源性水腫,在caveolin-1的表達(dá)增加的同時,發(fā)現(xiàn)了occludin和claudin-5表達(dá)的減少[12]。此外,BBB的完整性,也為某些生理?xiàng)l件的影響,包括炎癥和氧化應(yīng)激。局部炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致血腦屏障破壞。在這一過程中,促炎性細(xì)胞因子,包括IL-1、iNOS、MPO和MMP-9,均可由腦損傷引起,同時抗炎癥相關(guān)因子arginase-1和IL-10因?yàn)楸Ｗo(hù)作用被激活。研究還發(fā)現(xiàn)中風(fēng)后過量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)導(dǎo)致血腦屏障完整性的破壞,而NOXs是ROS的主要來源。[13-20]綜上所述,腦外傷后導(dǎo)致血腦屏障的破壞,而維系血腦屏障的緊密連接蛋白異常及炎癥和氧化應(yīng)激均會導(dǎo)致血腦屏障通透性增加,從而出現(xiàn)血管源性水腫、顱內(nèi)壓增高,出現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀,而治療上目前無FDA批準(zhǔn)的腦外傷的治療,既往研究發(fā)現(xiàn)格列本脲、柴胡皂甙、丁酸鈉等藥物對創(chuàng)傷性腦損傷后的血腦屏障的破壞有保護(hù)作用,且Yang等對既往中草藥治療TBI的文獻(xiàn)進(jìn)行meta分析,結(jié)果顯示中藥對TBI治療有益,且有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但有局限性,表明更精心設(shè)計(jì)和報告的動物研究是必要的[21-24]。蟲草素(cordycepin)又稱蟲草菌素,具有抗炎、清除體內(nèi)自由基抗氧化、抗腫瘤、抗白血病、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂等作用[25],Tuli等研究發(fā)現(xiàn)蟲草素能明顯減弱促炎癥因子的水平,包括NO、PGE2、TNF-α和IL-1,同時增加抗炎因子的表達(dá),如IL-10[26]。此外,蟲草素可減少與年齡相關(guān)的氧化應(yīng)激,改善大鼠抗氧化能力[27]。蟲草素通過抗氧化性能和抑制凋亡細(xì)胞死亡來發(fā)揮對海馬細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用[28]。因此,有必要探討蟲草素是否對腦外傷后血腦屏障受損有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過使用TBI大鼠作為體外模型,運(yùn)用多種技術(shù),包括神經(jīng)缺損嚴(yán)重程度的評價、伊萬思藍(lán)評估、實(shí)時熒光定量PCR、Western blotting和ELISA等,來探討蟲草素是否通過抑制炎癥、抗氧化應(yīng)激和緊密連接蛋白的減少來改善腦外傷后的血腦屏障破壞,并為臨床上找到一種治療TBI的新辦法。方法1.使用SD大鼠隨機(jī)分組并通過經(jīng)典的控制皮層沖擊傷裝置制作TBI大鼠模型。2.損傷嚴(yán)重程度的評價。根據(jù)1996年chen[29]等進(jìn)行神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度評分,采用10分量表,0分代表正常,10分代表最嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損。3.腦含水量的測定:按照Hatashita等應(yīng)用干濕重法測定傷后24小時腦組織含水量。[30]4.伊文思藍(lán)的評價:通過術(shù)后伊萬思藍(lán)滲漏評價BBB的通透性。5.實(shí)時熒光定量PCR:損傷24小時后,組織勻漿后應(yīng)用RNA裂解緩沖液,根據(jù)試劑盒指示分別提取RNA、合成cDNA和其后的qPCR來測定ZO-1、occludin、IL-Iβ、iNOS、MMP-9、arginase-1、NOX-1、NOX-2、NOX-4、GADPH 作為內(nèi)參對照。6.Western blotting:如上所述,收集24小時后損傷組織,應(yīng)用Western blotting來觀察組成血腦屏障的ZO-1和Occludin的表達(dá)情況。7.ELISA:參照western blotting方法提取損傷24小時后總蛋白,根據(jù)試劑盒的指示來檢測IL-10。最后結(jié)果是以pg/mg來顯示.8.評估MPO和NOX的活性:應(yīng)用MPO測試盒(比色法)和光澤精增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法來評估MPO和NOX的活性。9.統(tǒng)計(jì):統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism軟件統(tǒng)計(jì)分析(GraphPad軟件、美國),用單因素方差分析和Tukey的事后檢驗(yàn)法。P值小于0.05被視為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三遍。結(jié)果1.蟲草素治療能改善TBI誘導(dǎo)的損傷,但呈劑量依賴假手術(shù)組大鼠接受相同的手術(shù),但均沒有影響皮質(zhì)。TBI大鼠分別用生理鹽水(對照組)或蟲草素(1、5、10和20mg/kg)。不同實(shí)驗(yàn)組動物的腦卒中嚴(yán)重程度以神經(jīng)系統(tǒng)損傷嚴(yán)重程度評分、腦含水量為特征。我們的研究結(jié)果表明,比假手術(shù)組,TBI大鼠有較高的神經(jīng)功能缺損程度評分和更多的腦水含量。此外,給予蟲草素干預(yù)治療后,比對照組表現(xiàn)出較低的神經(jīng)功能缺損程度評分和較少的腦水含量,表明蟲草素可以治療腦外傷引起的損傷。此外,蟲草素的治療作用具有劑量依賴性,在我們的實(shí)驗(yàn)中,20mg/kg的蟲草素改善TBI的效果最好。2.蟲草素治療可保護(hù)TBI后的BBB的完整性。伊萬思藍(lán)可以評定BBB的完整性,因?yàn)橐寥f思藍(lán)滲漏與BBB完整性的損失呈正相關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)對照組血腦屏障完整性受損,而20mg/kg蟲草素治療組可部分挽救TBI誘導(dǎo)的BBB完整性的損失。伊萬思藍(lán)的含量分析進(jìn)一步證實(shí),蟲草素可治療TBI誘導(dǎo)的血腦屏障完整性受損。此外,假手術(shù)組大鼠,作為陰性對照組,在受損的對側(cè),伊萬思藍(lán)含量和蟲草素處理組沒有差異。3.蟲草素能減輕TBI誘導(dǎo)的同側(cè)皮層緊密連接蛋白的損失。假手術(shù)組和TBI組相比較,假手術(shù)組大鼠的ZO-1和occludin轉(zhuǎn)錄水平較低。此外,在假手術(shù)組大鼠和假手術(shù)組+蟲草素組之間及TBI+對照組和TBI+蟲草素組之間ZO-1和occludin的mRNA水平各自相似。其后通過免疫印跡法檢測兩者的蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示與mRNA結(jié)果一致,TBI大鼠組(TBI +對照組和TBI+蟲草素組)ZO-1和occludin蛋白水平較低。然而,對ZO-1和occludin蛋白條帶強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)TBI+蟲草素組顯著高于TBI +對照組,表明蟲草素能減輕TBI誘導(dǎo)緊密連接蛋白的損失,但不影響基因�？傊�,蟲草素可能在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。4.蟲草素能抑制腦損傷同側(cè)大腦的局部炎癥。我們分析了促炎因子和抗炎因子的水平,包括IL-Iβ、iNOS、MMP-9、MPO和arginase-1、IL-10,正如預(yù)期的那樣,局部炎癥在TBI后同側(cè)大腦引起,但被蟲草素抑制。同時,TBI誘導(dǎo)的腦損害刺激抗炎癥因子產(chǎn)生,而蟲草素可以進(jìn)一步加強(qiáng)這種作用。5.蟲草素能抑制NADPH oxidase(NOX)在TBI后同側(cè)大腦的表達(dá)和活性。我們的研究結(jié)果證實(shí),腦損傷大鼠組NOX活性比對照組高,而蟲草素治療TBI大鼠組比TBI對照組大鼠NOX活性低。NOX-1、NOX-2和NOX-4是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在NOXs的三種類型[31]。我們進(jìn)一步研究三種NOXs的mRNA的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在TBI誘導(dǎo)的大鼠中只有NOX-1,它卻在TBI大鼠中蟲草素治療后被抑制。但NOX-2和NOX-4不受TBI誘導(dǎo)的損傷影響,也不被蟲草素治療影響。結(jié)論1.蟲草素對腦外傷引起的腦損傷有保護(hù)作用,且呈劑量依賴性。2.蟲草素可以改善腦外傷引起的血腦屏障的破壞。3.蟲草素對血腦屏障的保護(hù)可能是通過恢復(fù)緊密連接蛋白ZO-1和occludin的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平、抑制局部炎癥反應(yīng)和降低NOX-1的活性來實(shí)現(xiàn)。意義1.我們對蟲草素改善創(chuàng)傷性腦損傷后血腦屏障完整性損害的機(jī)制進(jìn)行了探討,首次提出蟲草素對腦外傷后血腦屏障的保護(hù)作用,發(fā)現(xiàn)蟲草素可以通過減少血腦屏障相關(guān)的緊密連接蛋白轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的丟失和通過抑制NOX-1而不是NOX-2、NOX-4的活性來改善腦外傷后血腦屏障的損害。2.蟲草素治療創(chuàng)傷性腦損傷大鼠有效,為我們治療創(chuàng)傷性腦損傷提供了一個新的治療方法,具有廣闊的前景。
[Abstract]:Background and Objective Traumatic brain injury is a kind of diseases caused by various trauma , such as high incidence rate , high disability rate and so on . In the United States alone , about 1.7 million new cases report annually , causing about 5 % of people to die , more than 40 % of those with long - term disability , and 25 % of adults . Therefore , it is very important to improve the outcome of blood brain barrier . BBB is very important in maintaining the stability of the central nervous system . In the intact structure of the blood brain barrier , the endothelial cells of brain microvascular endothelial cells are formed by three transmembrane protein connections , which are directly or indirectly bound to the small band protein - 1 ( zonulatio dens - 1 , ZO - 1 ) in the tight connexin . It was found that in a cold injury model of a rat , the cortical layer produced pure angioedema , while the expression of cyclin din and claudin - 5 was reduced at the same time as the expression increased . In addition , the integrity of BBB is also influenced by some physiological conditions , including inflammation and oxidative stress . Local inflammatory reaction can lead to the destruction of blood brain barrier . In this process , pro - inflammatory cytokines , including IL - 1 , iNOS , MPO and MMP - 9 , can be caused by brain injury , while anti - inflammatory factors such as IL - 1 , iNOS , MPO and MMP - 9 can be activated by protective action . Conclusion Traditional Chinese medicine has the protective effect on the blood - brain barrier after traumatic brain injury . The results show that the traditional Chinese medicine has the protective effect on the blood - brain barrier after traumatic brain injury , and the result shows that the traditional Chinese medicine has the advantages of anti - inflammatory , free radical oxidation , anti - tumor , anti - leukemia , anti - bacterial , immunoregulation , blood sugar reduction and blood fat reducing . In addition , cepin can reduce age - related oxidative stress and improve the antioxidant capacity of rats . Cordyceps sinensis plays a role in neuroprotection of hippocampus cells by inhibiting oxidation resistance and inhibiting apoptosis cell death . In this experiment , it is necessary to study whether or not it has protective effect on blood - brain barrier after brain injury . This experiment uses multiple techniques , including evaluation of severity of nerve defect , Evans blue evaluation , real - time fluorescence quantitative PCR , Western blotting and ELISA . The expression of MPO and NOx was assessed by Western blotting and Western blotting . 5 . Cordyceps sinensis could inhibit the expression and activity of NADPH oxidase ( NOx ) in the ipsilateral brain following the development of the rats . The results of our study confirmed that the activity of NOx in the rats with brain injury was higher than that in the control group , while those in the control group were lower than those in the control group . The NOX - 1 , NOx - 2 and NOx - 4 were the three types of NOx31 in the central nervous system . 1 . The protective effect of cepin on the blood - brain barrier induced by brain injury was discussed . The protective effect of cepin on blood - brain barrier induced by brain injury was discussed .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R651.15;R-332

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 毛寧;張麗艷;張鳳梅;陳秀娟;;離子交換樹脂分離純化蟲草素的工藝條件研究[J];藥物生物技術(shù);2010年05期

2 史玉俊;;8—溴—蟲草素具有抑制腫瘤活性[J];國外醫(yī)藥(植物藥分冊);1989年01期

3 楊杰;陳順志;;蟲草素研究進(jìn)展[J];中國生化藥物雜志;2008年06期

4 李泳;余潮彬;張兆霞;張軍;莊旭忠;邢U，

本文編號：1711321