本文選題：急性肝衰竭　切入點：脂多糖　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：背景：肝衰竭是多種因素（病毒、藥物、肝毒性物質(zhì)、酒精、遺傳代謝性疾病等）引起的嚴重肝臟損害，導(dǎo)致其合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴重障礙或失代償，出現(xiàn)以凝血功能障礙、黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群。急性肝衰竭（acute liverfailure, ALF）是其中一種亞型，起病急、死亡率高，發(fā)病2周內(nèi)出現(xiàn)Ⅱ度以上肝性腦病。其發(fā)病機制復(fù)雜，目前尚不十分清楚�，F(xiàn)已明確，腸源性內(nèi)毒素血癥在ALF的疾病進展中發(fā)揮著重要作用。內(nèi)毒素的主要成分為脂多糖（lipopolysaccharide, LPS），其主要效應(yīng)細胞是單核巨噬細胞。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)LPS可激活巨噬細胞內(nèi)Notch信號通路發(fā)揮多種生物學(xué)功能。目前關(guān)于Notch信號通路與炎癥關(guān)系的研究尚存在爭議，尤其是對白介素-10（interleukin-10, IL-10）的影響，有研究顯示Notch信號通路可促進IL-10的分泌，但也有研究顯示其可抑制IL-10的分泌。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)LPS激活巨噬細胞Notch信號通路與晚期炎癥介質(zhì)高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1, HMGB1）的分泌有關(guān)。HMGB1是內(nèi)毒素血癥中重要的晚期炎癥介質(zhì)，推測HMGB1在ALF的進展中也發(fā)揮著舉足輕重的作用。目前，臨床上應(yīng)用益生菌輔助治療肝病患者已取得很好的療效，其可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)，降低腸道內(nèi)毒素的產(chǎn)生和吸收，減少血液循環(huán)中內(nèi)毒素的含量，從而改善內(nèi)毒素血癥，對受損的肝臟起保護作用。但對其具體的作用機制尚不明確，且缺乏相關(guān)研究。肝衰竭死亡率高，雖然肝移植是最有效的治療方法，但肝源奇缺、費用昂貴的矛盾仍非常突出。因此肝衰竭的預(yù)防顯得尤為重要。非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）是目前僅次于病毒性肝炎的第二大肝病病因，NAFLD患者比健康人群更易進展為肝衰竭。早期診斷和治療NAFLD，可在一定程度上預(yù)防肝衰竭的發(fā)生。非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH）是NAFLD疾病進展的重要限速步驟，因此NASH的早期診斷已成為肝衰竭的主要防治工作之一。 目的：本研究通過腹腔注射D-氨基半乳糖建立小鼠ALF模型，并應(yīng)用益生菌干預(yù)模型小鼠，通過檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanineaminotransferase, ALT），天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase,AST）、IL-10、HMGB1及血漿LPS水平，肝組織內(nèi)Jagged1、Notch1、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白以及巨噬細胞活化標記物CD68的表達，同時行肝組織病理染色，觀察益生菌干預(yù)后肝組織病理改變，以及LPS、IL-10、HMGB1與Notch信號通路相關(guān)指標的表達變化及意義；體外培養(yǎng)小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞，應(yīng)用LPS和Notch信號通路的特異性阻斷劑氮 [氮 （3，5-二氟苯乙酰） L 丙氨酰] S 苯基甘氨酸丁酯（N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L alanyl)]-S phenylglycinet-butyl ester, DAPT）進行干預(yù)，觀察細胞上清液IL-10、HMGB1水平和細胞內(nèi)Notch信號通路相關(guān)指標的表達變化，明確Notch信號通路在外源性LPS刺激巨噬細胞分泌細胞因子中的調(diào)控作用；同時應(yīng)用正常小鼠血漿、ALF小鼠血漿和益生菌干預(yù)小鼠血漿分別刺激小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞，觀察細胞上清液LPS、IL-10、HMGB1水平和細胞內(nèi)Notch信號通路相關(guān)指標的表達變化，從整體、組織、細胞及分子水平探討益生菌對于ALF的可能作用機制，為臨床應(yīng)用益生菌預(yù)防ALF提供新的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。此外，還通過檢測NAFLD患者血清中與NAFLD發(fā)病密切相關(guān)的指標變化，應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法進行分析處理，建立NASH的無創(chuàng)診斷模型，從而為NASH的早期診斷，也為肝衰竭的預(yù)防提供新思路。 方法： 1益生菌對急性肝衰竭小鼠Notch信號通路的影響 健康清潔級6-8周齡雄性BALB/c小鼠30只，體重（18-20）g，由河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。用標準飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機分為以下三組：a正常對照組10只：標準飼料喂養(yǎng)；b ALF模型組10只：標準飼料喂養(yǎng)，給予生理鹽水（與益生菌干預(yù)組劑量相同）灌胃2周，于2周末腹腔注射3.0g/kg的D-氨基半乳糖（以生理鹽水溶解，濃度為60mg/ml）；c益生菌干預(yù)組10只：標準飼料喂養(yǎng)，給予益生菌（金雙歧）900mg/kg/d（生理鹽水配成100mg/ml混懸液）灌胃2周，于2周末腹腔注射3.0g/kg的D-氨基半乳糖（以生理鹽水溶解，濃度為60mg/ml）。于腹腔注射3.0g/kg D-氨基半乳糖（造模）36小時處死全部小鼠，留取血清、血漿及肝組織。應(yīng)用全自動生化分析儀測定血清ALT、AST水平；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）法測定血清IL-10、HMGB1水平；鱟試劑盒檢查血漿LPS水平；取部分肝組織以10%中性甲醛溶液固定，用于常規(guī)蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerasechain reaction, real time-PCR）法檢測小鼠肝組織Jagged1、Notch1和Hes5mRNA的表達；Western Blot法檢測小鼠肝組織Jagged1、Notch1、NICD和Hes5蛋白的表達變化；免疫組織化學(xué)染色方法檢測小鼠肝組織CD68的表達。 2Notch信號通路在脂多糖刺激巨噬細胞分泌細胞因子中的調(diào)控作用 小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心。將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞接種在六孔板中，每孔5×105個細胞，用含10%胎牛血清和90%高糖DMEM培養(yǎng)至70%融合時進行分組干預(yù)。正常對照組：常規(guī)培養(yǎng)加入DMSO（劑量與LPS+DAPT組相同）培養(yǎng)24小時后，再加入1×PBS緩沖液（劑量與LPS組相同）繼續(xù)培養(yǎng)30小時；LPS組：常規(guī)培養(yǎng)加入DMSO（劑量與LPS+DAPT組相同）培養(yǎng)24小時后，再加入LPS（100ng/ml）繼續(xù)培養(yǎng)30小時；LPS+DAPT組：常規(guī)培養(yǎng)加入DAPT（10μM）培養(yǎng)24小時后[15]，再加入LPS（100ng/ml）繼續(xù)培養(yǎng)30小時；收取細胞及上清液。ELISA法測定細胞上清液IL-10、HMGB1水平；Real time-PCR法檢測RAW264.7細胞Notch1、Hes5mRNA的表達；Western Blot法檢測RAW264.7細胞NICD、Hes5蛋白的表達變化。 3益生菌干預(yù)小鼠血漿調(diào)控巨噬細胞分泌細胞因子的分子機制 將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞接種在六孔板中，每孔5×105個細胞，用含10%胎牛血清和90%高糖DMEM培養(yǎng)至70%融合時進行分組干預(yù)。正常小鼠血漿干預(yù)組：80%細胞完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清+90%高糖DMEM）+20%正常小鼠血漿培養(yǎng)48小時；ALF小鼠血漿干預(yù)組：80%細胞完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清+90%高糖DMEM）+20%ALF小鼠血漿培養(yǎng)48小時；益生菌干預(yù)小鼠血漿干預(yù)組：80%細胞完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清+90%高糖DMEM）+20%益生菌干預(yù)小鼠血漿培養(yǎng)48小時；收取細胞及上清液。ELISA法測定細胞上清液IL-10、HMGB1和LPS水平；Real time-PCR法檢測血漿干預(yù)RAW264.7細胞Jagged1、Notch1、Hes5mRNA的表達；Western Blot法檢測血漿干預(yù)RAW264.7細胞Jagged1、Notch1、NICD、Hes5蛋白的表達。 4細胞角蛋白18、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、血小板、甘油三酯聯(lián)合預(yù)測非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)生 入選患者均需行肝活檢，診斷符合中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組制定的非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版），同時排除酒精性脂肪性肝�。�5年內(nèi)乙醇攝入量男性≥40克/天或女性≥20克/天）或過量飲酒（男性乙醇攝入量≥140克/周或女性≥70克/周）；病毒性肝炎；自身免疫性肝病；藥物或毒物誘導(dǎo)的肝損害；遺傳代謝性疾�。╓ilson’s病、血色素沉著癥、α1抗胰蛋白酶缺乏癥等）；膽道梗阻。根據(jù)肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果，，將所有納入的研究對象分為兩組，即非-非酒精性脂肪性肝炎組（non-nonalcoholic steatohepatitis, non-NASH）和NASH組。計算患者體重指數(shù)、腰臀比；詢問是否合并糖尿病、高血壓、血脂異常及吸煙習(xí)慣；檢測血清ALT、AST、總膽紅素（total bilirubin,TB）、白蛋白（albumin, ALB）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase, γ-GT）、國際標準化比率（international normalized ratio, INR）、血小板、白細胞（white blood cell,WBC）、肌酐、尿酸（Uric acid, UA）、空腹血糖（fasting glucose, FG）、甘油三酯（triglycerides, TG），膽固醇（total cholesterol, TC）、血紅蛋白、超敏反應(yīng)蛋白（hs-Creactive protein, hs-CRP）和鐵蛋白水平；ELISA法測定血清細胞角蛋白18（cytokeratin18, CK18）凋亡片段M30的水平。 實驗數(shù)據(jù)以x±ｓ表示，單因素方差分析前進行正態(tài)性及方差齊性檢驗，Least-Significant-Difference法進行組間比較，雙側(cè)P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P0.01為有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)性分析采用直線相關(guān)分析法。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)。 結(jié)果： 1益生菌對急性肝衰竭小鼠Notch信號通路的影響 1.1小鼠的一般情況：正常對照組小鼠精神狀態(tài)良好，食欲旺盛，對外界刺激或痛覺反應(yīng)正常；ALF模型組小鼠精神萎靡，進食減少，動作遲緩，對外界刺激反應(yīng)減弱；益生菌干預(yù)組小鼠精神、食欲及對界外刺激反應(yīng)介于正常對照組與ALF模型組之間。 1.2小鼠生化指標、血清HMGB1、IL-10及血漿LPS水平變化：ALF模型組小鼠血清ALT（848.404±94.828U/L）、AST（911.490±67.652U/L）、HMGB1（101.909±12.428μg/L）、IL-10（4627.884±842.453pg/ml）和血漿LPS（11.801±0.887EU/ml）水平均高于正常對照組（38.994±9.628U/L、55.279±7.499U/L、20.733±5.369μg/L、1064.924±238.455pg/ml、0.578±0.119EU/ml）（P值均0.01）；而益生菌干預(yù)組血清ALT（689.891±84.649U/L）、 AST （776.026±61.892U/L）、 HMGB1（82.556±9.719μg/L）、IL-10（3182.596±769.235pg/ml）和血漿LPS（7.396±0.919EU/ml）水平均較ALF模型組明顯降低（P值均0.01）。 1.3肝組織病理學(xué)變化：光鏡下，HE染色可見正常對照組小鼠肝組織內(nèi)大小一致的肝細胞圍繞肝小葉中央靜脈呈放射狀分布，肝細胞排列整齊，肝索結(jié)構(gòu)完整；ALF模型組小鼠肝組織正常結(jié)構(gòu)被破壞，肝索結(jié)構(gòu)紊亂，可見大面積肝細胞壞死及大量炎性細胞浸潤，殘存肝細胞腫脹，呈氣球樣變；益生菌干預(yù)組小鼠肝細胞壞死、變性及炎性細胞浸潤程度均較ALF模型組改善。 1.4肝組織Jagged1、Notch1、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白的表達：ALF模型組小鼠肝組織內(nèi)Jagged1、Notch1、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白的表達量均較正常對照組明顯增加（P值均0.01）；而益生菌干預(yù)組上述指標的表達水平均較ALF模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均0.01或0.05）。 1.5肝組織CD68蛋白的表達：ALF模型組小鼠肝組織CD68蛋白（0.631±0.067μm2）較正常對照組（0.339±0.071μm2）明顯增加（P0.01）；與ALF模型組比較，益生菌干預(yù)組CD68蛋白表達量（0.460±0.094μm2）明顯減少（P0.01）。 1.6相關(guān)性分析 小鼠血漿LPS水平與ALT、AST、Jagged1mRNA、Notch1mRNA、Hes5mRNA、Jagged1蛋白、Notch1蛋白、NICD蛋白、Hes5蛋白、血清HMGB1、IL-10水平及肝組織CD68蛋白的表達水平均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.936、0.946、0.947、0.945、0.948、0.894、0.829、0.926、0.907、0.942、0.900、0.973（P值均0.01）。 2Notch信號通路在脂多糖刺激巨噬細胞分泌細胞因子中的調(diào)控作用 2.1RAW264.7細胞上清液中HMGB1和IL-10的含量變化：正常對照組細胞上清液中可檢測出低水平的HMGB1（0.213±0.046μg/L）和IL-10（59.192±23.304pg/ml）。經(jīng)LPS刺激后細胞上清液HMGB（17.441±0.634μg/L）和IL-10（315.188±79.133pg/ml）水平均有不同程度的升高（P值均0.01），其中以HMGB1升高為主；應(yīng)用DAPT進行特異性阻斷后，細胞上清液HMGB1（6.218±0.711μg/L）和IL-10（252.060±57.633pg/ml）水平均較LPS刺激組下降明顯，以HMGB1下降最為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值0.01或0.05）。 2.2DAPT特異性阻斷劑對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞Notch1mRNA、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白的影響：RAW264.7細胞經(jīng)LPS刺激后，細胞內(nèi)Notch1mRNA、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白水平均較正常對照組明顯升高（P值均0.01）；加入DAPT特異性阻斷劑進行干預(yù)后，與LPS刺激組比較，上述指標的表達水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均0.01）。 2.3相關(guān)性分析 小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞上清液中HMGB1水平與Notch1mRNA、Hes5mRNA、NICD蛋白和Hes5蛋白均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.849、0.933、0.833、0.866（P值均0.01）；細胞上清液中IL-10水平也與Notch1mRNA、Hes5mRNA、NICD蛋白和Hes5蛋白呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.798、0.810、0.821、0.834（P值均0.01）。 3益生菌干預(yù)小鼠血漿調(diào)控巨噬細胞分泌細胞因子的分子機制 3.1小鼠血漿干預(yù)RAW264.7細胞上清液中HMGB1、IL-10和LPS的含量變化：正常小鼠血漿干預(yù)組細胞上清液中HMGB1（3.433±0.674μg/L）、IL-10（286.524±33.507pg/ml）和LPS（0.090±0.014EU/ml）水平較低；ALF小鼠血漿干預(yù)組細胞上清液中HMGB1（34.691±9.058μg/L）、IL-10（1812.736±185.574pg/ml）和LPS（2.102±0.121EU/ml）水平則較正常小鼠血漿干預(yù)組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均0.01）；與ALF小鼠血漿干預(yù)組比較，益生菌干預(yù)小鼠血漿干預(yù)組細胞上清液HMGB1（20.058±2.278μg/L）、IL-10（1338.322±151.339pg/ml）和LPS（1.220±0.069EU/ml）水平均明顯下降（P值均0.01）。 3.2小鼠血漿干預(yù)RAW264.7細胞內(nèi)Jagged1、Notch1、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白的表達變化：RAW264.7細胞經(jīng)ALF小鼠血漿干預(yù)后，細胞內(nèi)Jagged1、Notch1、Hes5mRNA和蛋白、NICD蛋白水平均較正常小鼠血漿干預(yù)組明顯升高（P值均0.01）；加入益生菌干預(yù)小鼠血漿后，與ALF小鼠血漿干預(yù)組比較，上述指標表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P值均0.01）。 3.3相關(guān)性分析 小鼠血漿干預(yù)RAW264.7細胞上清液LPS水平與Jagged1mRNA、Notch1mRNA、Hes5mRNA、Jagged1蛋白、Notch1蛋白、NICD蛋白、Hes5蛋白、細胞上清液HMGB1和IL-10水平均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.969、0.911、0.955、0.931、0.889、0.937、0.940、0.913、0.965（P值均0.01）。 4細胞角蛋白18、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、血小板、甘油三酯聯(lián)合預(yù)測非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)生 4.1人口學(xué)及實驗室指標的變化：Non-NASH組和NASH組患者年齡、性別構(gòu)成比、吸煙習(xí)慣、糖尿病、高血壓、血脂異常、收縮壓、舒張壓、血清TB、WBC、血紅蛋白、肌酐、INR、FG、TC和鐵蛋白水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P0.05），而NASH患者BMI、WHR、血清AST、ALT、ALP、γ-GT、UA、hs-CRP、TG和血小板水平均較non-NASH組明顯升高，血清ALB水平則明顯降低（均P0.05）。 4.2血清CK18片段M30水平及其與肝組織病理學(xué)特征的相關(guān)性分析： NASH組患者血清CK18片段M30水平（372.9U/L（319.6,431.4））較non-NASH組（248.1U/L（237.5,266.6））明顯升高（P0.001）。其與肝組織脂變（r=0.492）、氣球樣變（r=0.211）、匯管區(qū)炎癥（r=0.346）和纖維化分級（r=0.407）均成正相關(guān)（P0.05或P0.01）。 4.3多變量分析：體重指數(shù)、腰臀比、血清AST、ALT、ALP、ALB、γ-GT、UA、hs-CRP、TG、CK-18片段M30及血小板均納入多變量模型分析。其中ALT、血小板、CK-18片段M30和TG是NASH的預(yù)測因素。四個指標的AUROC分別為0.811（95%CI：0.722-0.899）、0.631（95%CI：0.515-0.746）、0.892（95%CI：0.824-0.960）和0.714（95%CI：0.611-0.818）。其中血清CK-18片段M30水平與ALT（r=0.639）和TG（r=0.390）水平均成正相關(guān)（均P0.05），而與血小板無相關(guān)性（P0.05）。 4.4NASH預(yù)測模型：Logistic回歸分析得出NASH預(yù)測模型，具體公式為-12.764+0.075×ALT（U/L）+0.013×血小板（×109/L）+0.012×CK-18片段M30（U/L）+0.006×TG（mg/dL）。該模型的AUROC為0.920（95%CI：0.866-0.974），臨界值為0.361，敏感性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值均為89%，特異性為86%。 結(jié)論： 1應(yīng)用D-氨基半乳糖腹腔注射小鼠可以成功復(fù)制ALF模型，其中血漿LPS水平的升高在ALF的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。 2ALF小鼠血漿中升高的LPS可使肝組織內(nèi)巨噬細胞活化，激活細胞內(nèi)Notch信號通路，促進晚期重要炎癥介質(zhì)HMGB1和抗炎細胞因子IL-10的分泌，其中以升高HMGB1為主，參與肝臟的炎癥損傷過程，加速ALF的疾病進展。 3益生菌可通過降低ALF小鼠血漿LPS水平，減少肝組織中巨噬細胞的活化，抑制Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低HMGB1和IL-10的水平，從而發(fā)揮保護肝臟的作用，為臨床預(yù)防ALF提供了新的思路和方向。 4由CK-18、ALT、血小板和甘油三酯組成的無創(chuàng)診斷模型可準確預(yù)測NASH的發(fā)生，該模型可能在延緩NAFLD病情進展，改善患者預(yù)后及預(yù)防肝衰竭中發(fā)揮一定作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R575.3

【參考文獻】

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1 樸正福;趙丹;張海燕;郭素珍;盧靜;王晶晶;李勝利;溫韜;戴潔;;大鼠慢加急性肝衰竭模型肝臟組織病理學(xué)特征研究[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2010年05期

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本文編號：1710449