本文選題：創(chuàng)傷性失血性休克　切入點：腸道細(xì)菌移位　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：第一部分創(chuàng)傷性失血性休克致腸道細(xì)菌移位的機制探討背景創(chuàng)傷性失血性休克(THS)誘導(dǎo)的腸道細(xì)菌及其毒素移位入侵是導(dǎo)致內(nèi)毒血癥、系統(tǒng)性感染、膿毒癥,繼而引起多臟器功能衰竭、甚至死亡的重要因素,但其具體機制尚未明確。腸道菌群過度繁殖、腸道粘膜屏障的損傷、宿主免疫功能缺陷是腸道細(xì)菌移位的三因素。而關(guān)于創(chuàng)傷性失血性休克后上述機制是否參與到腸道細(xì)菌移位中尚缺乏一個統(tǒng)一的認(rèn)識。實驗?zāi)康谋狙芯繑M在小鼠THS模型的基礎(chǔ)上,以腸道細(xì)菌移位三因素作為切入點,研究THS是否能引起腸道細(xì)菌移位及其具體機制。材料與方法本研究將小鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham組)和創(chuàng)傷性失血性休克組(THS組)。Sham組僅接受切開、縫合、結(jié)扎等假手術(shù)操作,THS組給予創(chuàng)傷并放血至平均動脈壓(MAP)在30±5 mmHg水平,90分鐘后予以補液復(fù)蘇。在該過程中監(jiān)測了MAP及腸道微循環(huán)灌注的動態(tài)變化。本研究還通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜鑒定技術(shù)檢測了腸外組織的細(xì)菌移位情況,通過16s rRNA測序法檢測了腸道菌群的組成,并作了聚類分析、PCA分析、稀釋曲線分析等來觀察分析THS對腸道菌群的組成、腸道菌種多樣性等的影響,并借助HE染色、FITC-Dextran、Ussing Chamber檢測了腸道粘膜結(jié)構(gòu)、通透性、電阻的改變。最后通過流式儀及多因子檢測試劑盒分析了小鼠THS后全身的免疫狀況。結(jié)果在本研究中,我們成功地用C57小鼠構(gòu)建了 THS模型,并在該模型的基礎(chǔ)上觀察到了腸道細(xì)菌主要是赫氏大腸桿菌移位至腸系膜淋巴結(jié)(MLN)、肝臟、脾臟,甚至是血液,細(xì)菌移位的發(fā)生率明顯高于Sham組小鼠。進一步分析原因,本研究發(fā)現(xiàn)了小鼠在THS后出現(xiàn)了以變形菌門埃希菌屬過度繁殖為主的腸道菌群紊亂、菌群組成顯著性改變以及腸道菌群多樣性下降等改變。此外,腸道粘膜屏障亦顯著損傷,出現(xiàn)了皺襞減少、變平、上皮下水腫、大量絨毛短鈍、增粗、倒伏及剝脫以至消失等損傷,以及腸道粘膜電阻下降、通透性增加等改變。此外,腸道微循環(huán)灌注在THS后始終處于較低的水平。更為重要的是,全身處于免疫抑制狀態(tài),以Th1/Th2平衡向Th2漂移、Th17減少、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增多、DC數(shù)目下降為主要表現(xiàn)。結(jié)論綜上,本研究認(rèn)為,THS會導(dǎo)致腸道細(xì)菌移位至MLN、肝臟、脾臟及血液明顯增加,以變形菌門埃希菌屬的赫氏大腸桿菌為主,這與休克后腸道菌群的紊亂、埃希菌屬細(xì)菌過度繁殖、菌群多樣性下降、腸道粘膜屏障損傷、全身免疫抑制相關(guān)。這三大原因很可能在THS后腸道細(xì)菌移位中扮演著互相促進的協(xié)同作用。而腸道粘膜微循環(huán)障礙、供氧不足導(dǎo)致的PH值的下降、缺血再灌注損傷引起的羥基自由基釋放的增加可能是導(dǎo)致腸道菌群紊亂、腸道粘膜屏障損傷的重要原因。宿主全身免疫障礙及其產(chǎn)生的具體機制仍是值得深入研究的一部分。第二部分TLR5-RA在腸粘膜固有層樹突狀細(xì)胞抵御創(chuàng)傷性失血性休克后腸道細(xì)菌移位中的作用及機制研究背景繼發(fā)于創(chuàng)傷和失血的嚴(yán)重的系統(tǒng)性感染是創(chuàng)傷性失血性休克(THS)導(dǎo)致死亡的最主要原因之一。特異性表達Toll樣受體5(TLR5)的腸道粘膜固有層樹突狀細(xì)胞(LPDCs)被認(rèn)為是廣泛分布于腸道上皮下的一群抗原遞呈細(xì)胞,其更容易接觸到腸道細(xì)菌抗原譬如TLR5受體的特異性配體鞭毛蛋白。受到鞭毛蛋白的刺激后,TLR5+ LPDCs能夠通過視黃酸的分泌誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的分化。但是,TLR5+ LPDCs及其通過視黃酸誘導(dǎo)產(chǎn)生的Th1是否參與到THS后的腸道細(xì)菌移位中尚不清楚。實驗?zāi)康谋狙芯康哪康氖菫榱擞^察TLR5+LPDCs在THS后腸道細(xì)菌移位中的作用及內(nèi)在機制。材料與方法野生型小鼠(WT)和TLR5敲除小鼠(TLR5-/-)被隨機分入假手術(shù)組(Sham組)或者創(chuàng)傷性失血性休克組(THS組)。在給予左側(cè)股骨中段橫斷性骨折后,小鼠被放血至平均動脈壓(MAP)達到30 ±5 mmHg水平,并在90分鐘后用乳酸林格液補液復(fù)蘇,在該過程中監(jiān)測小鼠MAP和腸道微循環(huán)灌注的改變。在生物性發(fā)光檸檬酸桿菌(C.R.)灌胃后5小時,取小鼠腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟和門靜脈血液,磨成勻漿后的組織和血涂板過夜培養(yǎng),然后在小動物活體成像儀下觀察生物學(xué)發(fā)光的C.R.菌落并計數(shù)。同時,本研究還監(jiān)測了 THS后腸道的跨膜電阻和通透性的改變。通過流式分選分出腸道粘膜固有層的CDllc和MHC II雙陽性的LPDCs,并通過流式檢測LPDCs細(xì)胞內(nèi)RA的表達情況及其誘導(dǎo)Thl細(xì)胞分化的情況。最后,通過灌胃給予小鼠RA治療,觀察RA能否抑制細(xì)菌移位及延長小鼠的生存期。結(jié)果本研究發(fā)現(xiàn),在WT小鼠,THS可以導(dǎo)致更多的腸道細(xì)菌移位至肝臟、脾臟和血液,而在TLR5-/-小鼠,無論是否發(fā)生THS,細(xì)菌移位的數(shù)量始終較低。而腸道粘膜電阻和腸道通透性等指標(biāo)提示,腸道機械屏障在THS后發(fā)生了損傷性的改變,但WT小鼠和TLR5-/-小鼠之間始終沒有差異。此外,兩種基因型小鼠的腸道微循環(huán)在THS后始終都處于低灌注水平且無差異,而這可能是THS后腸道粘膜損傷的原因。此外,我們發(fā)現(xiàn)在腸道粘膜固有層原位,WT小鼠擁有較多的Thl細(xì)胞,且在THS后下降,而TLR5-/-小鼠的原位Thl數(shù)量始終較低。進一步研究發(fā)現(xiàn),小鼠腸道粘膜固有層來源的CDllc、MHCII雙陽性的LPDCs特異性表達TLR5,且其產(chǎn)生RA的能力和體外誘導(dǎo)Th1分化的水平擁有一致的趨勢。在WT小鼠,TLR5+ LPDCs在THS后RA的產(chǎn)量和誘導(dǎo)的Th1分化下降,而Tlr5-8-小鼠LPDCs產(chǎn)生RA的水平和誘導(dǎo)Th1分化的能力并不受THS打擊的影響。值得注意的是,RA受體拮抗劑LE540可以明顯下降WT小鼠來源的LPDCs誘導(dǎo)的Th1的分化。最后,RA灌胃給藥能夠明顯緩解WT小鼠THS后的腸道細(xì)菌移位,卻不能緩解TLR5-/-小鼠的細(xì)菌移位。結(jié)論TLR5+LPDCs通過刺激TLR5,介導(dǎo)RA的產(chǎn)生,誘導(dǎo)腸道局部的Th1的分化,從而抵抗腸道細(xì)菌移位,但該機制在THS后不再起作用。另一方面,RA治療可能通過模擬TLR5-RA依賴的LPDCs的免疫功能而緩解腸道細(xì)菌移位。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R605.971

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1 張劍;TLR5-RA在腸粘膜固有層樹突狀細(xì)胞抵御創(chuàng)傷性失血性休克后腸道細(xì)菌移位中的作用及機制研究[D];浙江大學(xué);2017年

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本文編號：1680095