本文選題：肺泡巨噬細(xì)胞　切入點(diǎn)：微小RNA-155(miR-155)　出處：《南昌大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：膿毒癥是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng),臨床表現(xiàn)從發(fā)熱、心率快到出現(xiàn)呼吸困難、血壓下降、意識模糊、尿少等器官功能障礙。膿毒癥是導(dǎo)致ICU重癥患者死亡的首位原因,即使經(jīng)過及時(shí)抗感染、支持治療,其死亡率仍高達(dá)20%~60%。膿毒癥患者最終死亡的主要原因?yàn)槟摱景Y引起的MODS,其中最常見的是ARDS。ARDS是一種危及生命的的臨床綜合征,死亡率30%~60%。臨床表現(xiàn)為頑固性低氧血癥,非心源性的呼吸衰竭;胸片表現(xiàn)為雙肺浸潤性肺水腫。ARDS的發(fā)病機(jī)制研究指出,肺泡巨噬細(xì)胞過度激活,炎癥介質(zhì)失控性釋放是導(dǎo)致膿毒癥肺損傷的主要原因。在失控性釋放的炎癥介質(zhì)中,TNF-α、IL-1β被認(rèn)為是最具生物活性的早期炎癥因子,可啟動(dòng)肺內(nèi)炎癥“瀑布”反應(yīng),造成急性肺損傷。自噬作為機(jī)體內(nèi)一種基本代謝機(jī)制,在營養(yǎng)代謝、腫瘤發(fā)生及炎癥免疫等方面有重要作用。目前研究已獲悉,自噬可清除細(xì)胞內(nèi)受損線粒體,阻止活性氧與線粒體DNA進(jìn)入胞漿,使Caspase-1活化受阻,使得IL-1β前體不能剪切為成熟的IL-1β。此外,微小RNA在生物體內(nèi)也發(fā)揮強(qiáng)大的生物調(diào)節(jié)功能。引起感染的病原微生物組分以及早期炎癥因子,如LPS、TNF-α、IL-1β等,可刺激單核巨噬細(xì)胞使得miR-155上調(diào);反過來,miR-155又與TLR炎癥通路中調(diào)節(jié)蛋白的mRNA結(jié)合,阻止其翻譯,抑制炎癥反應(yīng)的擴(kuò)散。盡管自噬和miR-155都能夠通過各自機(jī)制來調(diào)控炎癥反應(yīng);但是,在炎癥反應(yīng)中自噬與miR-155是否有關(guān)聯(lián)尚不清楚。因此,弄清炎癥反應(yīng)與自噬、miR-155三者之間關(guān)系,發(fā)現(xiàn)它們相互作用的機(jī)制,將有助于膿毒癥肺損傷的預(yù)防治療和研發(fā)治療此病的新型藥物。第一部分LPS刺激NR8383細(xì)胞后炎癥反應(yīng)與自噬、mi R-155變化目的:觀察LPS刺激NR8383細(xì)胞后炎癥因子、自噬蛋白及miR-155表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化,探討膿毒癥時(shí)炎癥反應(yīng)與自噬及miR-155三者之間關(guān)系。方法:常規(guī)培養(yǎng)NR8383細(xì)胞,LPS刺激0.5、3、6、12、24小時(shí)后收集細(xì)胞和細(xì)胞上清液;采用ELISA檢測細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1;采用Western Blot檢測細(xì)胞中的lc3Ⅱ/Ⅰ、tab2、caspase-1;采用rt-qpcr檢測細(xì)胞中mir-155。結(jié)果:正常組tnf-α、il-1分別為20.12±7.20與894.34±77.98pg/ml,pbs組tnf-α、il-1分別為19.63±6.51與1024.50±113.47pg/ml,兩組比較無明顯差異(p0.05)。lps刺激0.5小時(shí)tnf-α、il-1為230.37±19.28與3281.50±263.29pg/ml,lps刺激3小時(shí)為360.35±33.28與3908.50±228.47pg/ml,lps刺激6小時(shí)為560.35±43.62與4601.84±301.27pg/ml,lps刺激12小時(shí)為860.46±84.62與6201.83±173.93pg/ml,lps刺激24小時(shí)為601.21±54.73與4008.62±247.45pg/ml。與正常組比較,lps刺激0.5、3、6、12、24小時(shí)的tnf-α、il-1均有明顯差異(p0.05);而且lps刺激12、24小時(shí)兩組比較有明顯差異(p0.05)。正常組lc3Ⅱ/Ⅰ比值為0.11±0.04,pbs組lc3Ⅱ/Ⅰ比值為0.09±0.06,兩組比較無明顯差異(p0.05)。lps刺激0.5小時(shí)lc3Ⅱ/Ⅰ比值為0.46±0.07,3小時(shí)為0.51±0.13,6小時(shí)為0.59±0.09,12小時(shí)為0.81±0.13,24小時(shí)為0.56±0.07。與正常組比較,lps刺激0.5、3、6、12、24小時(shí)lc3Ⅱ/Ⅰ比值均有明顯差異(p0.05);而且lps刺激12、24小時(shí)兩組比較有明顯差異(p0.05)。與正常組比較,pbs組tab2表達(dá)為0.83±0.11倍,lps刺激0.5小時(shí)tab2表達(dá)為1.2±0.17倍,3小時(shí)為0.93±0.12倍,6小時(shí)為1.2±0.04倍,12小時(shí)為1.04±0.17倍,24小時(shí)為1.27±0.09倍。各組間均無明顯差異(p0.05)。與正常組比較,pbs組caspase-1表達(dá)為1.1±0.20倍(p0.05),lps刺激0.5小時(shí)caspase-1表達(dá)為4.82±0.32倍(p0.05),3小時(shí)為8.23±0.41倍(p0.05),6小時(shí)為11.29±0.54倍(p0.05),12小時(shí)為12.63±0.39倍(p0.05),24小時(shí)為9.87±0.49(p0.05)。而且lps刺激12、24小時(shí)兩組比較有明顯差異(p0.05)。與正常組比較,pbs組mir-155表達(dá)為0.91±0.33倍(p0.05),lps刺激0.5小時(shí)mir-155表達(dá)為1.21±0.19倍(p0.05),lps刺激3小時(shí)為1.41±0.20倍(p0.05),lps刺激6小時(shí)為1.74±0.18倍(p0.05),lps刺激12小時(shí)為3.11±0.12倍(p0.05),lps刺激24小時(shí)為7.82±0.30倍(p0.05)。結(jié)論:lps刺激nr8383細(xì)胞后,炎癥反應(yīng)增強(qiáng),12小時(shí)達(dá)到峰值。mir-155的表達(dá)逐漸增強(qiáng),自噬也逐漸增強(qiáng),且都呈現(xiàn)時(shí)間依賴模式。此外,caspase-1表達(dá)增加的趨勢與炎癥反應(yīng)增強(qiáng)的趨勢一致。第二部分mir-155影響自噬及自噬調(diào)控炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制目的:探討mir-155影響自噬以及自噬調(diào)控炎癥反應(yīng)的機(jī)制。方法:上調(diào)mir-155后,以lps刺激nr8383細(xì)胞,12小時(shí)后收集細(xì)胞和細(xì)胞上清液。采用elisa檢測細(xì)胞上清液中tnf-α、il-1,采用westernblot檢測細(xì)胞中的lc3Ⅱ/Ⅰ、tab2及caspase-1。隨后抑制mir-155,仍以lps刺激nr8383細(xì)胞,12小時(shí)后收集細(xì)胞和細(xì)胞上清液進(jìn)行上述的檢測。結(jié)果:1.與正常細(xì)胞比較,mir-155mimics轉(zhuǎn)染nr8383細(xì)胞24小時(shí)后mir-155表達(dá)為236.73±46.49倍(p0.01)。正常組tnf-α、il-1分別為18.83±5.65與583.83±47.29pg/ml,lps組tnf-α、il-1分別為774.84±59.23與5806.28±167.01pg/ml,lps+mimics組tnf-α、il-1分別為347.84±27.16與2087.27±83.20pg/ml。組間比較均有明顯差異(p0.05)。正常組lc3Ⅱ/Ⅰ比值為0.13±0.04,lps組lc3Ⅱ/Ⅰ比值為0.49±0.11,lps+mimics組lc3Ⅱ/Ⅰ比值為0.79±0.14。組間比較均有明顯差異(p0.05)。與正常組比較,lps組tab2表達(dá)為0.92±0.08倍(p0.05),lps+mimics組tab2表達(dá)為0.32±0.04倍(p0.05);lps+mimics組與lps組比較有明顯差異(p0.05)。與正常組比較,lps組caspase-1表達(dá)為11.57±0.23倍,lps+mimics組caspase-1表達(dá)為7.27±0.16倍。組間比較均有明顯差異(p0.05)。2.與正常細(xì)胞比較,mir-155inhibitor轉(zhuǎn)染nr8383細(xì)胞24小時(shí)后mir-155表達(dá)為1.6±0.34倍(p0.05)。正常組tnf-α、il-1分別為17.45±3.90與558.40±45.31pg/ml,lps組tnf-α、il-1分別為581.27±60.14與5506.37±114.47pg/ml,lps+inhibitor組tnf-α、il-1分別為811.38±45.68與7036.08±120.63pg/ml。組間比較均有明顯差異(p0.05)。正常組lc3Ⅱ/Ⅰ比值為0.14±0.02,lps組lc3Ⅱ/Ⅰ比值為0.65±0.11,lps+inhibitor組lc3Ⅱ/Ⅰ比值為0.43±0.06。組間比較均有明顯差異(p0.05)。與正常組比較,lps組tab2表達(dá)為1.23±0.16倍(p0.05),lps+inhibitor組tab2表達(dá)為2.11±0.30倍(p0.05)。lps+inhibitor組與lps組比較有明顯差異(p0.05)。與正常組比較,lps組caspase-1表達(dá)為12.60±0.31倍,lps+inhibitor組caspase-1表達(dá)為15.16±0.29倍。組間比較均有明顯差異(p0.05)。結(jié)論:上調(diào)mir-155后,自噬反應(yīng)增強(qiáng);抑制mir-155后,自噬反應(yīng)減弱。mir-155通過其靶蛋白tab2,又稱為自噬反應(yīng)的分子開關(guān),與自噬反應(yīng)聯(lián)動(dòng)。自噬負(fù)性調(diào)控caspase-1,避免其剪切成熟的il-1,從而發(fā)揮調(diào)控炎癥的功能。第三部分導(dǎo)入大鼠體內(nèi)的mir-155對炎癥反應(yīng)、自噬的影響目的:用invivo-jetpeitm試劑將mir-155導(dǎo)入大鼠肺內(nèi),觀察大鼠肺內(nèi)炎癥損傷及自噬小體形成,研究mir-155對膿毒癥大鼠肺保護(hù)作用及機(jī)制。方法:選擇9只雄性成年sd大鼠,分為正常組、lps組、lps+mir-155組,每組3只。lps組大鼠氣管內(nèi)滴入lps(7.5mg/kg),誘導(dǎo)大鼠ali模型,6小時(shí)成模后處死。lps+mir-155組大鼠氣管內(nèi)預(yù)先滴入invivo-jetpeitm試劑荷載的mir155mimics(40μg/只),24小時(shí)后再滴入lps(7.5mg/kg),6小時(shí)后處死。正常組大鼠也完成相應(yīng)操作,氣管內(nèi)滴入生理鹽水,6小時(shí)后處死。3組大鼠腹主動(dòng)脈采血行血?dú)夥治?取左肺相同部位的肺組織測量濕/干重比,常規(guī)病理切片he染色,電鏡觀察自噬小體;右肺balf離心后,上清液和細(xì)胞分別用于檢測炎癥因子tnf-α、il-1和mir-155。結(jié)果:與正常組比較,lps組大鼠balf分離細(xì)胞的mir-155表達(dá)為5.87±0.34倍(p0.05),lps+mir-155組大鼠balf分離細(xì)胞的mir-155表達(dá)為95.23±16.84倍(p0.01)。正常組大鼠balf中tnf-α、il-1分別為48.51±8.21與678.64±55.32pg/ml;lps組tnf-α、il-1分別為745.99±34.45與5482.10±119.57pg/ml;lps+mir-155組分別為364.68±23.00與2349.38±55.09pg/ml。組間比較均有差異(p0.05)。正常組大鼠兩肺無水腫,無出血;lps組大鼠兩肺有多個(gè)出血點(diǎn),有明顯水腫;lps+mir-155組大鼠兩肺外觀介于二者之間。正常組大鼠肺w/d比值為4.17±0.22,lps組大鼠肺w/d比值為5.61±0.26,lps+mir-155組大鼠肺w/d比值為4.97±0.20;組間比較均有差異(p0.05)。正常組大鼠氧合指數(shù)為420.63±34.96mmhg,lps組大鼠氧合指數(shù)為271.42±23.46mmhg,lps+mir-155組氧合指數(shù)為315.76±16.08mmhg;組間比較均有差異(p0.05)。正常組大鼠肺組織病理切片顯示細(xì)胞無腫脹,結(jié)構(gòu)整齊;lps組大鼠肺組織病理切片顯示細(xì)胞、細(xì)胞間隙腫脹,結(jié)構(gòu)紊亂;lps+mir-155組大鼠肺組織病理切片表現(xiàn)介于二者之間。正常組大鼠巨噬細(xì)胞電鏡顯示未見自噬小體形成;LPS組大鼠巨噬細(xì)胞電鏡顯示見2個(gè)自噬小體形成;LPS+miR-155組大鼠巨噬細(xì)胞電鏡顯示見7個(gè)自噬小體形成。結(jié)論:經(jīng)氣管導(dǎo)入大鼠體內(nèi)的miR-155通過上調(diào)自噬減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R459.7

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