本文選題：膿毒癥　切入點(diǎn)：microRNAs　出處：《南開(kāi)大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：既往研究表明血清miRNAs可以作為膿毒癥患者的生物學(xué)標(biāo)記物。本研究旨在發(fā)現(xiàn)膿毒癥相關(guān)的新的miRNAs標(biāo)記物和蛋白標(biāo)記物。本研究的研究目的分為以下幾點(diǎn)：(1)利用niRNAs芯片技術(shù)在全基因范圍內(nèi)篩選膿毒癥患者生存組和死亡組間差異表達(dá)的miRNAs,并在大樣本血樣中進(jìn)行驗(yàn)證,以期篩選新的miRNAs生物學(xué)標(biāo)記物。(2)利用Solexa測(cè)序技術(shù)預(yù)測(cè)新的miRNAs前體,并在臨床樣本中進(jìn)行驗(yàn)證,以發(fā)現(xiàn)新的miRNAs。(3)研究前期研究中篩選的六種miRNAs中同膿毒癥過(guò)程中的凝血功能紊亂相關(guān)的miRNAs。(4)研究已發(fā)現(xiàn)的miRNAs標(biāo)記物預(yù)測(cè)靶基因編碼蛋白是否為膿毒癥患者的生物標(biāo)記物。方法：本研究中涉及的實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括miRNAs芯片分析,Solexa測(cè)序分析,熒光定量PCR技術(shù)及相關(guān)的生物信息學(xué)分析。具體的實(shí)驗(yàn)方法如下：(1)利用12張niRNAs芯片在年齡,性別,病情嚴(yán)重程度匹配的12例生存組和12例死亡組膿毒癥患者間篩選差異表達(dá)的miRNAs。然后在118例膿毒癥患者中將上述篩選到的差異表達(dá)的niRNAs行qRT-PCR驗(yàn)證。(2)對(duì)年齡,性別,病情嚴(yán)重程度匹配的9例膿毒癥生存患者和9例膿毒癥死亡患者的血清樣本行Solexa測(cè)序分析,利用測(cè)序過(guò)程中預(yù)測(cè)到的新miRNAs行生物信息學(xué)分析,去除假的miRNAs前體,剩余的新miRNAs在膿毒癥患者血清中利用熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。(3)測(cè)定膿毒癥凝血功能正常和凝血功能異常患者血清中miR-223,miR-15a,miR-16, miR-193b*,miR-122和miR-483-5p的表達(dá)水平。并研究在兩組差異表達(dá)miRNAs水平同常用凝血指標(biāo)的相關(guān)性。最終研究miRNAs水平同相關(guān)凝血指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化。(4)對(duì)既往研究中鑒定的六種可以作為膿毒癥生物學(xué)標(biāo)記物的miRNAs進(jìn)行靶基因鑒定和功能注釋。然后利用ELISA方法檢測(cè)膿毒癥患者血清中這些靶基因編碼蛋白的含量。以鑒定膿毒癥患者新的血清蛋白標(biāo)記物。結(jié)果：總結(jié)為一下幾點(diǎn)：(1)經(jīng)過(guò)miRNAs芯片篩選發(fā)現(xiàn),miR-297和miR-574-5p在膿毒癥生存者和死亡者間差異表達(dá)。在118例膿毒癥患者血清中驗(yàn)證后,這兩個(gè)niRNA在兩組間差異表達(dá),且P0.001。研究證實(shí)miR-297同膿毒癥患者的生存相關(guān),而miR-574-5p同膿毒癥的死亡相關(guān)。多因素二分類logistic回歸分析顯示,膿毒癥階段,SOFA評(píng)分和miR-574-5p可以聯(lián)合預(yù)測(cè)膿毒癥患者的病死率。這三個(gè)變量聯(lián)合預(yù)測(cè)膿毒癥病死率的曲線下面積為0.932(95%可信區(qū)間,0.887-0.977)。當(dāng)截?cái)帱c(diǎn)為0.288時(shí),這三個(gè)變量的聯(lián)合預(yù)測(cè)膿毒癥患者病死率的敏感性為78.13%,特異性為91.84%。(2)經(jīng)過(guò)Solexa測(cè)序分析共預(yù)測(cè)得到650種新的miRNAs前體。利用生物信息學(xué)分析后篩選到45種新的miRNAs,將這些新的miRNAs在10例生存組患者,10例死亡組患者和10例健康對(duì)照患者中行熒光定量PCR驗(yàn)證,最終驗(yàn)證得到41種新的miRNA。在這41種新的miRNA中,18種新miNRAs共同存在于生存組和死亡組,9種miRNAs在兩組間差異表達(dá)。在24例死亡患者和32例生存組患者間利用熒光定量PCR驗(yàn)證這9種miRNA,結(jié)果6種新miRNAs差異表達(dá)。將6種miRNAs與嚴(yán)重程度評(píng)分(急性生理和慢性健康評(píng)估Ⅱ評(píng)分,APAHCE Ⅱ評(píng)分和序貫器官衰竭評(píng)分,SOFA評(píng)分)的聯(lián)合分析表明,這6種miRNA的預(yù)測(cè)病死率的曲線下面積為0.969(95%可信區(qū)間,0.930-1.000)。當(dāng)截?cái)帱c(diǎn)在0.714時(shí),6種miRNA預(yù)測(cè)膿毒癥患者病死率的靈敏度為100%和特異度為82.6%。(3)在六種mniRNAs中,僅血清miR-122的水平在凝血異常(CA)組患者顯著高于凝血正常組(CN)患者(P0.001)。血清miR-122的水平同活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)(R=0.426,P=0.008)和纖維蛋白原(FIB,R=0.398,P=0.008)正相關(guān),同抗凝血酶Ⅲ(R=-0.913,P0.001)負(fù)相關(guān)。此外,miR-122同谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST),的相關(guān)性系數(shù)分別為0.663(P0.001)和0.445(P=0.001)。在45例膿毒癥患者血清中動(dòng)態(tài)研究發(fā)現(xiàn),在CA組中,miR-122水平在入ICU的第1天,第3天,第7天和第10天顯著高于CN組,但是ISTH-DIC評(píng)分在兩組間無(wú)顯著性差異。(4)經(jīng)過(guò)靶基因預(yù)測(cè),ACVR2A(激活素A受體ⅡA型),FOXO1(叉頭框01),IHH(印度刺猬),STK4(絲氨酸/蘇氨酸激酶4)和DUSP3(雙特異性磷酸酶3)作為最終篩選得到的預(yù)測(cè)靶基因,其編碼的蛋白質(zhì)將用于下一步膿毒癥蛋白標(biāo)志物的鑒定。ACVR2A (P0.01)和FOXO1(P0.01)水平在正常對(duì)照組,輕癥膿毒癥患者,重癥膿毒癥患者和膿毒性休克患者之間有顯著差異。此外,ACVR2A (P=0.025), FOXO1(P0.001), IHH (P=0.001)和STK4(P=0.001)水平在生存組與死亡組間差異表達(dá)。DUSP3水平在組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)4種差異表達(dá)蛋白質(zhì)聯(lián)合分析表明,這四種蛋白預(yù)測(cè)病死率的曲線下的面積是0.875[95%置信區(qū)間：0.785-0.965],這要高于SOFA評(píng)分(序貫器官衰竭評(píng)估)和APACHEⅡ(急性生理和慢性健康評(píng)估Ⅱ)評(píng)分。當(dāng)預(yù)測(cè)概率的截?cái)帱c(diǎn)為0.449時(shí),四種蛋白預(yù)測(cè)膿毒癥患者病死率的敏感性為68%,特異性為91%。蛋白水平動(dòng)態(tài)研究表明,在所有的時(shí)間點(diǎn),ACVR2A, FOXO1和IHH水平在生存組與死亡組間均差異表達(dá)。這四種蛋白聯(lián)合預(yù)測(cè)膿毒癥患者28天病死率的價(jià)值要高于SOFA評(píng)分和APACHE Ⅱ評(píng)分。 結(jié)論：(1)miR-297和miR-574-5p在膿毒癥患者生存組和死亡組間差異表達(dá),而miR-574-5p,膿毒癥階段和APAHCHE Ⅱ評(píng)分聯(lián)合預(yù)測(cè)膿毒癥病死率具有較好的敏感性和特異性。 (2)膿毒癥患者的血清中存在大量未注釋的小RNA序列,本研究新發(fā)現(xiàn)41種新的miRNAs,其中6種miRNAs聯(lián)合預(yù)測(cè)膿毒癥病死率的價(jià)值較高。 (3)miR-122同膿毒癥過(guò)程中凝血功能紊亂相關(guān),其中與抗凝血酶Ⅲ高度負(fù)相關(guān)。 (4)膿毒癥相關(guān)miRNAs的靶基因編碼蛋白可以作為膿毒癥的生物學(xué)標(biāo)記物。FOXO1可以作為膿毒癥患者診斷和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記物。
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【學(xué)位授予單位】：南開(kāi)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R459.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉向強(qiáng);湯善宏;張志勇;靳海峰;;轉(zhuǎn)錄因子FOXO4在大腸癌中的表達(dá)及意義[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2011年09期

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本文編號(hào)：1608682