本文關(guān)鍵詞： 膿毒癥 LPS 急性腎損傷 腎小管上皮細(xì)胞 巨噬細(xì)胞 NFκB　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：一、研究背景膿毒癥(sepsis)的發(fā)病機(jī)制是機(jī)體一種失控的全身性炎癥反應(yīng),是一種復(fù)雜的臨床綜合征,表現(xiàn)為各種炎癥介質(zhì)的過度釋放,引起廣泛的細(xì)胞和組織損傷,進(jìn)一步可導(dǎo)致膿毒性休克、嚴(yán)重膿毒癥甚至多器官功能障礙綜合征。而腎臟是膿毒癥發(fā)生和發(fā)展過程中最易受到損傷的器官,急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)是最常見的并發(fā)癥之一,是死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。近年來的研究進(jìn)一步認(rèn)識(shí)了膿毒癥AKI的發(fā)生機(jī)制包括:腎微循環(huán)障礙導(dǎo)致腎臟灌注不足,腎小球周的毛細(xì)血管網(wǎng)循環(huán)失調(diào),炎癥標(biāo)志物與氧化應(yīng)激增加對(duì)腎小管的毒性作用,級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活和器官高代謝反應(yīng)至致細(xì)胞死亡等。在這些發(fā)病機(jī)制中,級(jí)聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)在膿毒癥AKI中起著舉足輕重的作用。Tec(Tyrosine kinase expressed in hepatocelluar carcinoma)是最早研究肝癌時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種酪氨酸蛋白激酶基因表達(dá)產(chǎn)物,Tec家族和其他兩個(gè)主要的酪氨酸蛋白激酶家族(Src、Syk激酶家族)被證實(shí)與炎癥反應(yīng)相關(guān)。Tec激酶家族的Tec、Src被證實(shí)在炎癥反應(yīng)中的早期即有激活并磷酸化,其活化亦可能與TLR早期活化相關(guān),對(duì)Tec激酶家族的干預(yù)試驗(yàn)已被用于一些自身炎癥性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。Tec激酶在膿毒癥所致的全身炎癥反應(yīng)中所發(fā)揮的機(jī)制目前研究甚少,一些研究認(rèn)為Tec非受體型激酶參與了感染導(dǎo)致膿毒癥的過程,并且認(rèn)為干預(yù)Tec激酶的治療可能是改善感染所致膿毒癥的新的靶點(diǎn)。在膿毒癥AKI的發(fā)生和發(fā)展過程中,Tec激酶的表達(dá)情況以及Tec激酶是否參與膿毒癥AKI的發(fā)生及其可能的機(jī)制,目前罕有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究部分旨在制造膿毒癥急性腎損傷模型,并且了解Tec激酶的腎內(nèi)表達(dá)情況,初步探討Tec激酶是否參與膿毒癥AKI的過程及其可能機(jī)制。二、研究目的1.在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,通過LPS誘導(dǎo)膿毒癥AKI模型的建立,研究Tec激酶在AKI腎組織中的表達(dá)變化,采用Tec激酶抑制劑進(jìn)一步研究對(duì)AKI腎功能的影響以驗(yàn)證其與AKI發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。同時(shí)了解不同組別之間腎組織TLR4、MYD88的表達(dá)、NF-κB通路活化情況及腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)來探討Tec激酶在AKI的可能作用機(jī)制。2.體外實(shí)驗(yàn)中觀察Tec激酶在LPS刺激誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子的影響;并通過使用Tec激酶抑制劑和其si RNA后了解其對(duì)炎癥介質(zhì)的分泌和MAPK和NF-κB通路活化的影響,期望通過上述研究進(jìn)一步認(rèn)識(shí)Tec激酶在膿毒癥AKI的發(fā)生發(fā)展中的可能機(jī)制,為AKI的治療提供新的靶點(diǎn)。三、研究?jī)?nèi)容第一部分膿毒癥小鼠AKI中Tec激酶蛋白的表達(dá)變化健康雄性清潔級(jí)成年C57BL/6小鼠32只,分2組,每組16只,LPS組給予LPS腹腔注射20mg/kg,正常對(duì)照組給予等量溶媒,分別于1h、6h、24h、48h每組4只小鼠,麻醉后心臟取血查血清IL-1β、TNF-ɑ及腎功能(肌酐、尿素氮、胱抑素C)并分離腎臟組織,病理學(xué)HE染色觀察組織結(jié)構(gòu),免疫組化觀察Tec激酶表達(dá),Western blot觀察Tec激酶、TLR4、NFκB-p65、p-NFκB-p65蛋白表達(dá)變化。第二部分Tec激酶蛋白抑制劑LFM-A13對(duì)膿毒癥小鼠AKI的保護(hù)作用健康雄性清潔級(jí)成年C57BL/6小鼠36只,分6組,每組6只,LPS組給予LPS腹腔注射20mg/kg,正常對(duì)照組給予等量溶媒,LPS+LFM-A13(40mg/kg)、LPS+LFM-A13(60mg/kg)、LPS+LFM-A13(80mg/kg)組分別在給予LPS20mg/kg腹腔注射后立即并分次給予LFM-A13(40mg/kg、60mg/kg、80mg/kg)腹腔給藥,LFM-A13組僅給予LFM-A13(60mg/kg)腹腔給藥,并補(bǔ)足小鼠腹腔灌注液體體積為1ml/20g,造模后24小時(shí),小鼠麻醉后心臟取血查血清IL-1β、TNF-ɑ及腎功能(肌酐、尿素氮、胱抑素C)并分離腎臟組織,病理學(xué)HE染色觀察組織結(jié)構(gòu),免疫組化觀察Tec激酶表達(dá),巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),Western blot觀察Tec激酶、myd88、TLR4、NFκB-p65、p-NFκB-p65蛋白表達(dá)變化。培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞系NRK-52E,分別以不同濃度的LPS(0ug/ml、0.01ug/ml、0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml)刺激,再以0.1ug/ml LPS刺激NRK-52E細(xì)胞不同時(shí)間(0min、15m、30min、60min、120min),提取細(xì)胞蛋白,Western blot檢測(cè)Tec激酶表達(dá)狀況。再觀察抑制劑的體外效果,LPS(0.1ug/ml)并加用不同濃度LFM-A13(50u M、75u M、100u M)預(yù)處理1h,提取細(xì)胞蛋白,Western blot檢測(cè)Tec激酶表達(dá)狀況。第三部分抑制Tec激酶蛋白表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響及機(jī)制培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW264.7,加用抑制劑LFM-A13(25u M、75u M)預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞1h,并0.1ug/ml LPS刺激1h,流式細(xì)胞術(shù)、q RT-PCR的方法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞上ICAM-1的表達(dá)水平,提取細(xì)胞蛋白,western blot檢測(cè)IκBα、NFκB-p65的蛋白表達(dá)及磷酸化水平及TAK-1的磷酸化水平,激光共聚焦檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中NFκB-p65核轉(zhuǎn)移狀況。Tec激酶si RNA干擾RAW264.7細(xì)胞特異性沉默Tec激酶基因表達(dá),并在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后給予LPS0.1mg/ml刺激RAW264.7細(xì)胞1h,提取細(xì)胞蛋白,western blot檢測(cè)TAK1、p-p38/p38和p-p65蛋白表達(dá)。四、研究結(jié)果第一部分建立小鼠LPS腹腔注射致膿毒癥AKI模型,LPS20mg/kg腹腔內(nèi)注射后1h即可見腎臟組織的輕度損傷及Cys C升高,6h可見血尿素氮升高,24h腎功能指標(biāo)均有明顯升高,并可見明顯的腎臟組織學(xué)損害。48h上述腎功能及腎臟組織損傷明顯改善。造模后1h即可見血清炎癥因子IL-1β和TNF-ɑ明顯升高,其中IL-1β在6h時(shí)升高最為明顯,TNF-ɑ在1h時(shí)升高最為明顯。造模后1h即可見腎內(nèi)Tec激酶及TLR4蛋白表達(dá)升高,持續(xù)致6h后開始下降,與正常對(duì)照組相比持續(xù)至48h均有升高。造模后6h可見NFκB-p65及其磷酸化水平明顯升高。腎組織免疫組化證實(shí)在LPS致膿毒癥建模后1h即可見腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)Tec激酶表達(dá)升高。第二部分小鼠腹腔注射LPS 24h后腎功能(肌酐、尿素氮、胱抑素C)明顯升高,腎組織損傷明顯,抑制劑LFM-A13給藥后各個(gè)劑量組均能明顯改善小鼠腎功能變化,同時(shí)明顯改善腎臟組織病理損傷。血清ELISA檢測(cè)提示LFM-A13明顯降低膿毒癥模型組IL-1β及TNF-ɑ水平。western blot結(jié)果提示LFM-A13明顯減少膿毒癥小鼠腎臟組織Tec激酶、MYD88、TLR4、NFκB-p65、p-NFκB-p65蛋白表達(dá)水平。免疫組化染色提示LFM-A13明顯減少腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)Tec激酶的表達(dá),并明顯減少膿毒癥小鼠腎內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。體外實(shí)驗(yàn)示濃度梯度LPS刺激大鼠腎小管上皮細(xì)胞系NRK-52E,0.1mg/ml即可見Tec激酶蛋白表達(dá)升高。時(shí)間效應(yīng)觀察0.1ug/ml LPS刺激大鼠腎小管上皮細(xì)胞后30min即可見Tec激酶表達(dá)的升高,持續(xù)升高致120min,抑制劑LFM-A13(50u M、75u M、100u M)可以明顯減少Tec激酶的表達(dá)。第三部分流式細(xì)胞術(shù)、q RT-PCR顯示LFM-A13減少LPS刺激后RAW264.7細(xì)胞ICAM-1的產(chǎn)生。Western blot示LFM-A13(25u M、75u M)下調(diào)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞后NFκB-p65及TAK1的活化;LPS刺激促進(jìn)了RAW264.7細(xì)胞胞漿內(nèi)IκBα蛋白的磷酸化降解和NFκB-p65的核轉(zhuǎn)移,進(jìn)而激活NFκB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化,而Tec激酶抑制劑LFM-A13預(yù)處理則明顯能抑制NFκB信號(hào)通路的活化,并明顯減少NFκB-p65的核轉(zhuǎn)移。Tec si RNA(Tec mus-790 RNAi)選擇性沉默Tec激酶m RNA表達(dá)后可明顯下調(diào)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞內(nèi)p-p38/p38、p-p65、p-TAK1/TAK1蛋白的表達(dá)水平。五、研究結(jié)論1.采用LPS(20mg/kg)腹腔內(nèi)注射后1h即可檢測(cè)出炎癥指標(biāo)的明顯升高,并出現(xiàn)早期腎功能損傷,以24小時(shí)最為明顯,其后呈現(xiàn)修復(fù)趨勢(shì)。膿毒癥AKI小鼠腎臟組織極早期便可檢測(cè)出Tec激酶的高表達(dá),并伴隨TLR4通路蛋白及下游細(xì)胞因子NFκB-p65的表達(dá)及活化水平的升高,提示Tec激酶參與了膿毒癥AKI的早期啟動(dòng)過程,并可能通過參與膿毒癥致炎癥損傷機(jī)制而發(fā)揮作用。2.LPS刺激的小鼠膿毒癥模型其腎臟組織中存在Tec激酶蛋白的過高表達(dá),并在腎小管上皮細(xì)胞中存在過高表達(dá)。LFM-A13在體內(nèi)及體外均能夠抑制腎小管上皮細(xì)胞中Tec激酶蛋白過高表達(dá),并可能通過抑制TLR4/MYD88信號(hào)通路,抑制NFκB-p65的活化,減少炎癥因子產(chǎn)生及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)等機(jī)制發(fā)揮防治AKI的作用,改善腎功能損傷及腎臟組織病理損傷。3.LFM-A13預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞以及si RNA沉默Tec激酶基因表達(dá)后,可抑制LPS刺激的Tec激酶過高表達(dá),并可能通過抑制TAK1通路干擾NFκB信號(hào)通路的活化并減少炎癥因子的釋放,從而發(fā)揮其在巨噬細(xì)胞中的抗炎作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R459.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1481698