本文關鍵詞： 機械創(chuàng)傷 成纖維細胞 干性 miR-21 輻射抵抗　出處：《第三軍醫(yī)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景創(chuàng)傷修復是一個復雜的生物學過程,涉及多種細胞、因子和細胞外基質(zhì)的協(xié)調(diào)有序的參與。皮膚是全身最大的器官也是最容易受到損傷的器官,其在抵御外來各種傷害、調(diào)節(jié)體溫、維持體內(nèi)外液體平衡方面均發(fā)揮著重要的作用,因此研究皮膚的創(chuàng)面愈合對于維持機體正常生理功能有重要的意義。影響創(chuàng)面修復的因素眾多,其中修復細胞起著主導作用,創(chuàng)傷后修復細胞在創(chuàng)面微環(huán)境的作用下發(fā)生增殖、遷移、分化、分泌、凋亡等生物學行為,任何影響修復細胞生物學過程的因素都能直接改變創(chuàng)面修復的結(jié)局。創(chuàng)面微環(huán)境是影響修復細胞生物學行為的重要因素,其主要由創(chuàng)面組織所處的外部環(huán)境和創(chuàng)面組織細胞直接接觸的內(nèi)部環(huán)境組成,創(chuàng)面微環(huán)境對修復細胞的生物學行為的影響是創(chuàng)面修復的核心問題之一。成纖維細胞是皮膚組織中主要細胞類型,既往的研究表明成纖維細胞在創(chuàng)面修復中發(fā)揮著重要的作用:創(chuàng)傷后在各種因素刺激下發(fā)生增殖和遷移,同時分泌大量的細胞外基質(zhì)填補創(chuàng)面,其還能分化為肌成纖維細胞收縮創(chuàng)面進一步加快創(chuàng)面缺損的修復。近來的研究表明成纖維細胞的異質(zhì)性很高,不同的細胞亞群在創(chuàng)面修復中發(fā)揮著不同的功能,比如真皮下層的成纖維細胞主要參與創(chuàng)面缺損的早期填充如形成肉芽組織,而上層的成纖維細胞則主要負責后期毛囊的重建。更值得關注的是成纖維細胞還具有極強的可塑性,目前成纖維細胞是誘導多能干細胞和直接的譜系間重編程時應用最廣,且成功率最高的種子細胞。成纖維細胞已被成功誘導為多種類型的細胞包括多能干細胞、心肌細胞、神經(jīng)元、神經(jīng)祖細胞、胰島細胞、造血干細胞等。但目前對于機械創(chuàng)傷后皮膚成纖維細胞可塑性尤其是干性和輻射反應性變化尚不完全明確,有待深入系統(tǒng)研究。研究方法1.體外機械創(chuàng)傷對皮膚成纖維細胞生物學特性影響應用了體外劃痕模型模擬創(chuàng)傷,劃痕后觀察不同時間點創(chuàng)緣成纖維細胞的細胞形態(tài)學改變,用Ki67檢測創(chuàng)傷后成纖維細胞被激活的時間,用干細胞相關標志物檢測創(chuàng)傷后成纖維細胞干細胞相關特性變化,用集落形成實驗檢測創(chuàng)傷后成纖維細胞自我更新能力的變化,用轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)合生物信息學分析方法檢測創(chuàng)傷后成纖維細胞轉(zhuǎn)錄水平的變化。2.創(chuàng)面微環(huán)境對皮膚成纖維細胞干細胞相關特性的影響首先建立了小鼠單存創(chuàng)傷模型,并分離出肉芽組織細胞,用cck-8、集落形成實驗、成脂、成骨誘導分化實驗檢測了肉芽組織細胞的生物學特性,將肉芽組織細胞局部移植到放射復合傷的小鼠創(chuàng)面,檢測其對創(chuàng)面愈合速度和質(zhì)量的影響,在前期實驗基礎上,結(jié)合mir-21拮抗劑檢測mir-21對肉芽組織細胞的生物學特性的影響,進一步結(jié)合ros清除劑證明mir-21調(diào)節(jié)肉芽組織生物學特性是否通過調(diào)節(jié)ros起作用。分離出野生型新生鼠真皮細胞和mir-21敲入新生鼠真皮細胞并結(jié)合mir-21拮抗劑和ros清除劑再次在新生鼠真皮細胞中證明mir-21/ros通路調(diào)控成纖維細胞的生物學特性。3.機械創(chuàng)傷對皮膚成纖維細胞輻射反應性的影響建立體內(nèi)和體外放射復合傷模型,通過檢測細胞的集落形成能力和細胞核γh2ax的表達,評估創(chuàng)傷和放射的時間順序?qū)ζつw成纖維細胞損傷的影響;用彗星實驗、pi/annexinv凋亡檢測、細胞周期檢測、微核檢測評估了創(chuàng)傷對皮膚成纖維細胞輻射反應的影響;通過檢測dna損傷修復相關蛋白表達評估創(chuàng)傷對皮膚成纖維細胞的輻射損傷修復的影響;用westernblot檢測pi3k/akt通路在劃痕損傷后皮膚成纖維細胞中的變化,并應用pi3k和gsk-3β抑制劑驗證結(jié)果;用westernblot和免疫熒光染色檢測創(chuàng)傷后成纖維細胞β-catenin的表達變化,用β-catenin的sirna抑制其表達后檢測了β-catenin對皮膚成纖維細胞干性的調(diào)節(jié)以及對輻射抵抗的作用;通過檢測創(chuàng)傷后成纖維細胞的ros水平、抗氧化蛋白的表達反應創(chuàng)傷對成纖維細胞抗氧化能力的影響;用westernblot和免疫熒光染色檢測創(chuàng)傷后成纖維細胞nrf2的表達變化;用nrf2的sirna抑制其表達后檢測了nrf2對皮膚成纖維細胞抗氧化能力和dna損傷修復能力的調(diào)節(jié)以及對輻射抵抗的作用。研究結(jié)果1.機械創(chuàng)傷對皮膚成纖維細胞生物學特性的影響1.1成功建立體外劃痕損傷模型,應用此模型發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷后皮膚成纖維細胞能被誘導為小圓細胞表型;約創(chuàng)傷后36h創(chuàng)緣成纖維細胞被激活,且其激活與創(chuàng)傷程度無關;創(chuàng)傷后創(chuàng)緣成纖維細胞的干細胞標志物sox2和vimentin表達明顯增高,而其它檢測的標志物未見明顯變化,集落形成能力也明顯增強。1.2創(chuàng)傷后成纖維細胞的轉(zhuǎn)錄組表達明顯變化:局部粘附信號通路,tgf-β信號通路和pi3k/akt信號通路、多能干細胞相關信號通路等均發(fā)現(xiàn)明顯的變化,局部粘附相關的分子、細胞周期相關分子、細胞遷移相關分子和dna損傷修復相關分子表達均明顯上調(diào)。2.創(chuàng)面微環(huán)境對皮膚成纖維細胞干細胞相關特性的影響2.1成功分離出創(chuàng)傷后的皮膚成纖維細胞(肉芽組織細胞),發(fā)現(xiàn)其具有較正常細胞更強的增殖、集落形成和成脂、成骨分化能力。移植肉芽組織細胞到放射復合傷小鼠創(chuàng)面能促進創(chuàng)面愈合速度,減少愈合后創(chuàng)面瘢痕中膠原沉積。2.2發(fā)現(xiàn)mir-21在肉芽組織細胞中高表達,應用mir-21拮抗劑antagomir能明顯促進肉芽組織細胞的增殖和集落形成能力,卻抑制其遷移和成脂、成骨誘導分化能力,提示mir-21能負向調(diào)控肉芽組織細胞的干性卻促進其遷移和分化。2.3發(fā)現(xiàn)mir-21能調(diào)控肉芽組織細胞中ros表達,應用ros清除劑nac能明顯促進肉芽組織細胞的增殖和集落形成能力卻抑制其遷移和成脂、成骨誘導分化能力,提示mir-21對肉芽組織細胞生物學特性影響是通過調(diào)控內(nèi)源性ros發(fā)揮作用的。2.4應用野生型新生鼠真皮細胞和mir-21新生鼠真皮細胞進一步驗證了mir-21通過調(diào)控內(nèi)源性ros而抑制皮膚成纖維細胞的增殖和集落形成能力而促進其遷移和成脂、成骨誘導分化能力。3.機械創(chuàng)傷對皮膚成纖維細胞輻射抵抗的影響3.1成功建立體外放射復合創(chuàng)傷模型并發(fā)現(xiàn)先創(chuàng)傷后照射較單純照射和先照射后創(chuàng)傷的皮膚成纖維細胞存活更多,而先照射后創(chuàng)傷較單純照射的成纖維細胞存活更少,進一步研究不同劑量照射后,先創(chuàng)傷后照射均較單純照射的成纖維細胞存活更多,提示創(chuàng)傷能增強皮膚成纖維細胞的輻射抵抗。但先創(chuàng)傷后照射的腫瘤細胞卻較單純照射的腫瘤細胞存活更少,提示創(chuàng)傷能增強腫瘤細胞的輻射敏感性。3.2先創(chuàng)傷后照射較單純照射成纖維細胞在照射后不同時間內(nèi)的γh2ax表達明顯減少,但在腫瘤細胞中結(jié)果卻相反;彗星實驗中先創(chuàng)傷后照射的成纖維細胞形成尾矩和拖尾中dna的含量均較單純照射的成纖維細胞少;先創(chuàng)傷后照射的成纖維細胞在照射后形成的微核數(shù)和凋亡細胞比例均較單純照射成纖維細胞明顯減少;3.3創(chuàng)傷后的成纖維細胞和未創(chuàng)傷的成纖維細胞在照射后均會發(fā)生明顯的細胞周期阻滯,前者主要阻滯在g2/m期,后者主要阻滯在g1/s期,而前者從g2/m期阻滯中恢復的時間較后者從g1/s期阻滯中恢復更快;照射后檢測dna損傷修復蛋白表達發(fā)現(xiàn),先創(chuàng)傷后照射成纖維細胞的同源重組修復蛋白rad51較單純照射的成纖維細胞明顯增高,而非同源重組蛋白表達未見明顯差異。而腫瘤細胞中修復相關蛋白未見明顯差異。3.4體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn),先創(chuàng)傷后照射組的皮膚成纖維細胞在照射后γh2ax的表達較單純照射后皮膚成纖維細胞消失更快;先創(chuàng)傷后照射小鼠肉芽組織細胞較先照射后創(chuàng)傷小鼠肉芽組織細胞具有更強的集落形成能力。3.5創(chuàng)傷后成纖維細胞2h內(nèi)激活態(tài)AKT表達明顯增高,同時其下游的P-S9 GSK-3β表達也明顯增高,GSK-3β被抑制后,首次發(fā)現(xiàn)其下游的Nrf2和β-catenin的表達同時增高,應用PI3K抑制劑能夠明顯逆轉(zhuǎn)創(chuàng)傷引起的Nrf2和β-catenin的增高,應用GSK-3β抑制劑能模擬創(chuàng)傷因素上調(diào)未創(chuàng)傷成纖維細胞中Nrf2和β-catenin表達,提示創(chuàng)傷激活了PI3K/AKT通路上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2和β-catenin.3.6創(chuàng)傷后β-catenin明顯上調(diào),結(jié)合應用其siRNA證明其能調(diào)控Sox2表達而增強皮膚成纖維細胞的干性,進而增強皮膚成纖維細胞的輻射抵抗。3.7創(chuàng)傷通過PI3K/AKT通路增強Nrf2表達,結(jié)合其siRNA證明:它一方面能上調(diào)SOD1表達而提高成纖維細胞的抗氧化能力,另一方面可部分調(diào)控RAD51的表達提高成纖維細胞的DNA損傷修復能力,進而增強皮膚成纖維細胞的輻射抵抗。研究結(jié)論1.體內(nèi)外實驗證明機械創(chuàng)傷能激活皮膚成纖維細胞發(fā)生增殖,其誘導增殖的時間窗為36h左右,且其誘導增殖與創(chuàng)傷嚴重程度無關;體外從細胞表型、轉(zhuǎn)錄組表達水平、干細胞特異的標志物等多方面首次證明機械創(chuàng)傷能增強皮膚成纖維細胞的干性。2.在體進一步證明機械創(chuàng)傷能明顯增強皮膚成纖維細胞的增殖、自我更新和多向分化潛能等干細胞相關生物學特性;并在此基礎上篩選并證明miR-21能通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性的ROS表達而負向調(diào)控成纖維細胞的增殖、自我更新等干性相關特性,但促進其遷移和分化。3.首次發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷和電離輻射損傷發(fā)生的時間順序能明顯影響復合效應對成纖維細胞的損傷程度即:創(chuàng)傷發(fā)生在前能明顯減輕電離輻射對細胞的損害,反之加重其對細胞的損害。而在腫瘤細胞中卻未見類似現(xiàn)象。4.機械創(chuàng)傷能激活成纖維細胞內(nèi)PI3K/AKT/GSK-3β信號通路,并首次發(fā)現(xiàn)其下游的β-catenin和Nrf2兩個轉(zhuǎn)錄因子同時上調(diào),進一步證明β-catenin能調(diào)控成纖維細胞的干性,Nrf2可同時調(diào)控成纖維細胞的抗氧化能力和DNA損傷修復能力,進而增強了成纖維細胞的輻射抵抗。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R641

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