本文關(guān)鍵詞： 機械創(chuàng)傷 成纖維細(xì)胞 干性 miR-21 輻射抵抗　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景創(chuàng)傷修復(fù)是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程,涉及多種細(xì)胞、因子和細(xì)胞外基質(zhì)的協(xié)調(diào)有序的參與。皮膚是全身最大的器官也是最容易受到損傷的器官,其在抵御外來各種傷害、調(diào)節(jié)體溫、維持體內(nèi)外液體平衡方面均發(fā)揮著重要的作用,因此研究皮膚的創(chuàng)面愈合對于維持機體正常生理功能有重要的意義。影響創(chuàng)面修復(fù)的因素眾多,其中修復(fù)細(xì)胞起著主導(dǎo)作用,創(chuàng)傷后修復(fù)細(xì)胞在創(chuàng)面微環(huán)境的作用下發(fā)生增殖、遷移、分化、分泌、凋亡等生物學(xué)行為,任何影響修復(fù)細(xì)胞生物學(xué)過程的因素都能直接改變創(chuàng)面修復(fù)的結(jié)局。創(chuàng)面微環(huán)境是影響修復(fù)細(xì)胞生物學(xué)行為的重要因素,其主要由創(chuàng)面組織所處的外部環(huán)境和創(chuàng)面組織細(xì)胞直接接觸的內(nèi)部環(huán)境組成,創(chuàng)面微環(huán)境對修復(fù)細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響是創(chuàng)面修復(fù)的核心問題之一。成纖維細(xì)胞是皮膚組織中主要細(xì)胞類型,既往的研究表明成纖維細(xì)胞在創(chuàng)面修復(fù)中發(fā)揮著重要的作用:創(chuàng)傷后在各種因素刺激下發(fā)生增殖和遷移,同時分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)填補創(chuàng)面,其還能分化為肌成纖維細(xì)胞收縮創(chuàng)面進一步加快創(chuàng)面缺損的修復(fù)。近來的研究表明成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性很高,不同的細(xì)胞亞群在創(chuàng)面修復(fù)中發(fā)揮著不同的功能,比如真皮下層的成纖維細(xì)胞主要參與創(chuàng)面缺損的早期填充如形成肉芽組織,而上層的成纖維細(xì)胞則主要負(fù)責(zé)后期毛囊的重建。更值得關(guān)注的是成纖維細(xì)胞還具有極強的可塑性,目前成纖維細(xì)胞是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和直接的譜系間重編程時應(yīng)用最廣,且成功率最高的種子細(xì)胞。成纖維細(xì)胞已被成功誘導(dǎo)為多種類型的細(xì)胞包括多能干細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)祖細(xì)胞、胰島細(xì)胞、造血干細(xì)胞等。但目前對于機械創(chuàng)傷后皮膚成纖維細(xì)胞可塑性尤其是干性和輻射反應(yīng)性變化尚不完全明確,有待深入系統(tǒng)研究。研究方法1.體外機械創(chuàng)傷對皮膚成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性影響應(yīng)用了體外劃痕模型模擬創(chuàng)傷,劃痕后觀察不同時間點創(chuàng)緣成纖維細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,用Ki67檢測創(chuàng)傷后成纖維細(xì)胞被激活的時間,用干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物檢測創(chuàng)傷后成纖維細(xì)胞干細(xì)胞相關(guān)特性變化,用集落形成實驗檢測創(chuàng)傷后成纖維細(xì)胞自我更新能力的變化,用轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)合生物信息學(xué)分析方法檢測創(chuàng)傷后成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的變化。2.創(chuàng)面微環(huán)境對皮膚成纖維細(xì)胞干細(xì)胞相關(guān)特性的影響首先建立了小鼠單存創(chuàng)傷模型,并分離出肉芽組織細(xì)胞,用cck-8、集落形成實驗、成脂、成骨誘導(dǎo)分化實驗檢測了肉芽組織細(xì)胞的生物學(xué)特性,將肉芽組織細(xì)胞局部移植到放射復(fù)合傷的小鼠創(chuàng)面,檢測其對創(chuàng)面愈合速度和質(zhì)量的影響,在前期實驗基礎(chǔ)上,結(jié)合mir-21拮抗劑檢測mir-21對肉芽組織細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響,進一步結(jié)合ros清除劑證明mir-21調(diào)節(jié)肉芽組織生物學(xué)特性是否通過調(diào)節(jié)ros起作用。分離出野生型新生鼠真皮細(xì)胞和mir-21敲入新生鼠真皮細(xì)胞并結(jié)合mir-21拮抗劑和ros清除劑再次在新生鼠真皮細(xì)胞中證明mir-21/ros通路調(diào)控成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性。3.機械創(chuàng)傷對皮膚成纖維細(xì)胞輻射反應(yīng)性的影響建立體內(nèi)和體外放射復(fù)合傷模型,通過檢測細(xì)胞的集落形成能力和細(xì)胞核γh2ax的表達,評估創(chuàng)傷和放射的時間順序?qū)ζつw成纖維細(xì)胞損傷的影響;用彗星實驗、pi/annexinv凋亡檢測、細(xì)胞周期檢測、微核檢測評估了創(chuàng)傷對皮膚成纖維細(xì)胞輻射反應(yīng)的影響;通過檢測dna損傷修復(fù)相關(guān)蛋白表達評估創(chuàng)傷對皮膚成纖維細(xì)胞的輻射損傷修復(fù)的影響;用westernblot檢測pi3k/akt通路在劃痕損傷后皮膚成纖維細(xì)胞中的變化,并應(yīng)用pi3k和gsk-3β抑制劑驗證結(jié)果;用westernblot和免疫熒光染色檢測創(chuàng)傷后成纖維細(xì)胞β-catenin的表達變化,用β-catenin的sirna抑制其表達后檢測了β-catenin對皮膚成纖維細(xì)胞干性的調(diào)節(jié)以及對輻射抵抗的作用;通過檢測創(chuàng)傷后成纖維細(xì)胞的ros水平、抗氧化蛋白的表達反應(yīng)創(chuàng)傷對成纖維細(xì)胞抗氧化能力的影響;用westernblot和免疫熒光染色檢測創(chuàng)傷后成纖維細(xì)胞nrf2的表達變化;用nrf2的sirna抑制其表達后檢測了nrf2對皮膚成纖維細(xì)胞抗氧化能力和dna損傷修復(fù)能力的調(diào)節(jié)以及對輻射抵抗的作用。研究結(jié)果1.機械創(chuàng)傷對皮膚成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性的影響1.1成功建立體外劃痕損傷模型,應(yīng)用此模型發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷后皮膚成纖維細(xì)胞能被誘導(dǎo)為小圓細(xì)胞表型;約創(chuàng)傷后36h創(chuàng)緣成纖維細(xì)胞被激活,且其激活與創(chuàng)傷程度無關(guān);創(chuàng)傷后創(chuàng)緣成纖維細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)志物sox2和vimentin表達明顯增高,而其它檢測的標(biāo)志物未見明顯變化,集落形成能力也明顯增強。1.2創(chuàng)傷后成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組表達明顯變化:局部粘附信號通路,tgf-β信號通路和pi3k/akt信號通路、多能干細(xì)胞相關(guān)信號通路等均發(fā)現(xiàn)明顯的變化,局部粘附相關(guān)的分子、細(xì)胞周期相關(guān)分子、細(xì)胞遷移相關(guān)分子和dna損傷修復(fù)相關(guān)分子表達均明顯上調(diào)。2.創(chuàng)面微環(huán)境對皮膚成纖維細(xì)胞干細(xì)胞相關(guān)特性的影響2.1成功分離出創(chuàng)傷后的皮膚成纖維細(xì)胞(肉芽組織細(xì)胞),發(fā)現(xiàn)其具有較正常細(xì)胞更強的增殖、集落形成和成脂、成骨分化能力。移植肉芽組織細(xì)胞到放射復(fù)合傷小鼠創(chuàng)面能促進創(chuàng)面愈合速度,減少愈合后創(chuàng)面瘢痕中膠原沉積。2.2發(fā)現(xiàn)mir-21在肉芽組織細(xì)胞中高表達,應(yīng)用mir-21拮抗劑antagomir能明顯促進肉芽組織細(xì)胞的增殖和集落形成能力,卻抑制其遷移和成脂、成骨誘導(dǎo)分化能力,提示mir-21能負(fù)向調(diào)控肉芽組織細(xì)胞的干性卻促進其遷移和分化。2.3發(fā)現(xiàn)mir-21能調(diào)控肉芽組織細(xì)胞中ros表達,應(yīng)用ros清除劑nac能明顯促進肉芽組織細(xì)胞的增殖和集落形成能力卻抑制其遷移和成脂、成骨誘導(dǎo)分化能力,提示mir-21對肉芽組織細(xì)胞生物學(xué)特性影響是通過調(diào)控內(nèi)源性ros發(fā)揮作用的。2.4應(yīng)用野生型新生鼠真皮細(xì)胞和mir-21新生鼠真皮細(xì)胞進一步驗證了mir-21通過調(diào)控內(nèi)源性ros而抑制皮膚成纖維細(xì)胞的增殖和集落形成能力而促進其遷移和成脂、成骨誘導(dǎo)分化能力。3.機械創(chuàng)傷對皮膚成纖維細(xì)胞輻射抵抗的影響3.1成功建立體外放射復(fù)合創(chuàng)傷模型并發(fā)現(xiàn)先創(chuàng)傷后照射較單純照射和先照射后創(chuàng)傷的皮膚成纖維細(xì)胞存活更多,而先照射后創(chuàng)傷較單純照射的成纖維細(xì)胞存活更少,進一步研究不同劑量照射后,先創(chuàng)傷后照射均較單純照射的成纖維細(xì)胞存活更多,提示創(chuàng)傷能增強皮膚成纖維細(xì)胞的輻射抵抗。但先創(chuàng)傷后照射的腫瘤細(xì)胞卻較單純照射的腫瘤細(xì)胞存活更少,提示創(chuàng)傷能增強腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性。3.2先創(chuàng)傷后照射較單純照射成纖維細(xì)胞在照射后不同時間內(nèi)的γh2ax表達明顯減少,但在腫瘤細(xì)胞中結(jié)果卻相反;彗星實驗中先創(chuàng)傷后照射的成纖維細(xì)胞形成尾矩和拖尾中dna的含量均較單純照射的成纖維細(xì)胞少;先創(chuàng)傷后照射的成纖維細(xì)胞在照射后形成的微核數(shù)和凋亡細(xì)胞比例均較單純照射成纖維細(xì)胞明顯減少;3.3創(chuàng)傷后的成纖維細(xì)胞和未創(chuàng)傷的成纖維細(xì)胞在照射后均會發(fā)生明顯的細(xì)胞周期阻滯,前者主要阻滯在g2/m期,后者主要阻滯在g1/s期,而前者從g2/m期阻滯中恢復(fù)的時間較后者從g1/s期阻滯中恢復(fù)更快;照射后檢測dna損傷修復(fù)蛋白表達發(fā)現(xiàn),先創(chuàng)傷后照射成纖維細(xì)胞的同源重組修復(fù)蛋白rad51較單純照射的成纖維細(xì)胞明顯增高,而非同源重組蛋白表達未見明顯差異。而腫瘤細(xì)胞中修復(fù)相關(guān)蛋白未見明顯差異。3.4體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn),先創(chuàng)傷后照射組的皮膚成纖維細(xì)胞在照射后γh2ax的表達較單純照射后皮膚成纖維細(xì)胞消失更快;先創(chuàng)傷后照射小鼠肉芽組織細(xì)胞較先照射后創(chuàng)傷小鼠肉芽組織細(xì)胞具有更強的集落形成能力。3.5創(chuàng)傷后成纖維細(xì)胞2h內(nèi)激活態(tài)AKT表達明顯增高,同時其下游的P-S9 GSK-3β表達也明顯增高,GSK-3β被抑制后,首次發(fā)現(xiàn)其下游的Nrf2和β-catenin的表達同時增高,應(yīng)用PI3K抑制劑能夠明顯逆轉(zhuǎn)創(chuàng)傷引起的Nrf2和β-catenin的增高,應(yīng)用GSK-3β抑制劑能模擬創(chuàng)傷因素上調(diào)未創(chuàng)傷成纖維細(xì)胞中Nrf2和β-catenin表達,提示創(chuàng)傷激活了PI3K/AKT通路上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2和β-catenin.3.6創(chuàng)傷后β-catenin明顯上調(diào),結(jié)合應(yīng)用其siRNA證明其能調(diào)控Sox2表達而增強皮膚成纖維細(xì)胞的干性,進而增強皮膚成纖維細(xì)胞的輻射抵抗。3.7創(chuàng)傷通過PI3K/AKT通路增強Nrf2表達,結(jié)合其siRNA證明:它一方面能上調(diào)SOD1表達而提高成纖維細(xì)胞的抗氧化能力,另一方面可部分調(diào)控RAD51的表達提高成纖維細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力,進而增強皮膚成纖維細(xì)胞的輻射抵抗。研究結(jié)論1.體內(nèi)外實驗證明機械創(chuàng)傷能激活皮膚成纖維細(xì)胞發(fā)生增殖,其誘導(dǎo)增殖的時間窗為36h左右,且其誘導(dǎo)增殖與創(chuàng)傷嚴(yán)重程度無關(guān);體外從細(xì)胞表型、轉(zhuǎn)錄組表達水平、干細(xì)胞特異的標(biāo)志物等多方面首次證明機械創(chuàng)傷能增強皮膚成纖維細(xì)胞的干性。2.在體進一步證明機械創(chuàng)傷能明顯增強皮膚成纖維細(xì)胞的增殖、自我更新和多向分化潛能等干細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)特性;并在此基礎(chǔ)上篩選并證明miR-21能通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性的ROS表達而負(fù)向調(diào)控成纖維細(xì)胞的增殖、自我更新等干性相關(guān)特性,但促進其遷移和分化。3.首次發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷和電離輻射損傷發(fā)生的時間順序能明顯影響復(fù)合效應(yīng)對成纖維細(xì)胞的損傷程度即:創(chuàng)傷發(fā)生在前能明顯減輕電離輻射對細(xì)胞的損害,反之加重其對細(xì)胞的損害。而在腫瘤細(xì)胞中卻未見類似現(xiàn)象。4.機械創(chuàng)傷能激活成纖維細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT/GSK-3β信號通路,并首次發(fā)現(xiàn)其下游的β-catenin和Nrf2兩個轉(zhuǎn)錄因子同時上調(diào),進一步證明β-catenin能調(diào)控成纖維細(xì)胞的干性,Nrf2可同時調(diào)控成纖維細(xì)胞的抗氧化能力和DNA損傷修復(fù)能力,進而增強了成纖維細(xì)胞的輻射抵抗。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R641

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