本文關(guān)鍵詞：青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受小鼠的保護(hù)作用及其作用機(jī)制的初步研究　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:膿毒癥(sepsis)是由感染因素引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic Inflammatory response syndrome,SIRS),膿毒癥進(jìn)一步發(fā)展導(dǎo)致的膿毒癥休克、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),是臨床危重患者死亡的主要原因,病死率高達(dá)30%~70%。膿毒癥的病理生理表現(xiàn)為炎癥風(fēng)暴(cytokine storm)和免疫抑制(immunosuppression)兩個(gè)階段。長(zhǎng)期以來,炎癥風(fēng)暴一直被認(rèn)為是膿毒癥的主要特征,因此將膿毒癥的研究焦點(diǎn)放在炎癥風(fēng)暴及其造成的MODS,并以此研究膿毒癥的防治措施,但是多種以抗炎為目的的治療策略卻均以失敗告終。近年來,來自臨床的報(bào)告顯示,雖然膿毒癥患者能度過前期的炎癥風(fēng)暴階段,但是許多卻因后期的繼發(fā)性感染和MODS而死亡,而這與患者處在免疫抑制階段、機(jī)體對(duì)病原微生物的二次打擊(second hit)抵抗力降低密切相關(guān)。單核/吞噬細(xì)胞是機(jī)體抵抗病原微生物的第一道防線,在識(shí)別、清除病原微生物以及抗原的處理、提呈中發(fā)揮重要作用。其功能抑制與機(jī)體對(duì)二次打擊抵抗力的降低密切相關(guān)。細(xì)菌內(nèi)毒素/脂多糖(endotoxin/lipopolysaccharide,LPS)是誘導(dǎo)膿毒癥的主要病原分子。內(nèi)毒素耐受將導(dǎo)致機(jī)體的過度免疫抑制,使機(jī)體更易遭受病原微生物的再次攻擊。通過建立內(nèi)毒素耐受模型可模擬臨床膿毒癥患者免疫抑制狀態(tài),為尋找治療膿毒癥有效藥物發(fā)揮重要作用�？汞懰幥噍镧�(Artesunate,AS)是含有倍半萜結(jié)構(gòu)的青蒿素衍生物,具有水溶性好、毒性低等優(yōu)點(diǎn)。我們課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯具有顯著的抗炎作用,基于其抗炎作用我們發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯對(duì)LPS攻擊小鼠、熱滅活大腸埃希菌(Escherichia coli,EC)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)攻擊小鼠、大腸埃希菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)活菌攻擊小鼠、盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)膿毒癥模型小鼠均具有顯著保護(hù)作用,該作用可能與其抑制TLR4、TLR9表達(dá),降低LPS水平以及抑制NF-κB活性有關(guān)。除具有顯著的抗炎作用外,有文獻(xiàn)報(bào)青蒿琥酯具有免疫調(diào)節(jié)作用。為研究青蒿琥酯是否可通過其免疫調(diào)節(jié)作用發(fā)揮對(duì)膿毒癥免疫抑制狀態(tài)的治療作用,本課題擬在建立內(nèi)毒素耐受及二次打擊小鼠、細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上,觀察青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受二次打擊模型小鼠的保護(hù)作用及其可能機(jī)制,為尋找有效治療膿毒癥的藥物并拓寬青蒿琥酯的臨床適應(yīng)癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:一、小鼠內(nèi)毒素耐受模型的建立與評(píng)價(jià)1.小鼠內(nèi)毒素耐受模型的初步建立與評(píng)價(jià)⑴模型的初步建立:連續(xù)5d腹腔注射1mg/kglps后,于第6d尾靜脈注射50mg/kglps。⑵模型的評(píng)價(jià):通過觀察小鼠7d死亡率;血清tnf-α及il-6釋放水平;小鼠對(duì)大腸埃希菌敏感性變化;小鼠血液中細(xì)菌數(shù)量的變化評(píng)價(jià)模型。2.小鼠內(nèi)毒素耐受模型的優(yōu)化與評(píng)價(jià)⑴模型的優(yōu)化:通過連續(xù)腹腔注射不同次數(shù)及不同劑量的lps后,再尾靜脈注射50mg/kglps,通過觀察小鼠體重及狀態(tài)變化確定最佳耐受模型的建立方案。⑵模型的評(píng)價(jià):通過觀察小鼠7d死亡率;血清、肺及脾tnf-α、il-6及il-1β釋放水平的變化;小鼠對(duì)銅綠假單胞菌敏感性變化評(píng)價(jià)模型。二、青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受及二次打擊模型小鼠的保護(hù)作用1.細(xì)胞因子檢測(cè):采用elisa法測(cè)定青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受模型小鼠血清、肺和脾tnf-α、il-6及il-1β釋放的影響。2.死亡率觀察:通過統(tǒng)計(jì)小鼠7d死亡率,觀察青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受二次打擊模型小鼠死亡率的影響。3.細(xì)菌清除能力研究:采用平板計(jì)數(shù)法觀察青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受二次打擊模型小鼠血液、肺和脾中細(xì)菌數(shù)量變化的影響。三、青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受模型小鼠保護(hù)作用機(jī)制的初步研究1.體外研究(1)內(nèi)毒素耐受細(xì)胞模型的建立與評(píng)價(jià):raw264.7細(xì)胞加入5ng/mllps預(yù)處理4h后再加入100ng/mllps;采用elisa法檢測(cè)上清tnf-α及il-6釋放水平。(2)細(xì)胞因子檢測(cè)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子檢測(cè):采用elisa法分別檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受模型細(xì)胞釋放tnf-α及il-6的影響及其對(duì)nf-κbp65及p50活化的影響;采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受模型細(xì)胞tlr4、traf6表達(dá)的影響。(3)細(xì)菌清除能力研究:內(nèi)毒素耐受細(xì)胞加入5.0×106cfu/ml銅綠假單胞菌建立內(nèi)毒素耐受二次打擊細(xì)胞模型;平板計(jì)數(shù)法觀察青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受二次打擊模型細(xì)胞細(xì)菌數(shù)量變化。2.體內(nèi)研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受模型小鼠肺和脾中重要信號(hào)分子tlr4、traf6蛋白表達(dá)及nf-κbp65蛋白活化的影響。結(jié)果:一、小鼠內(nèi)毒素耐受模型的建立與評(píng)價(jià)1.小鼠內(nèi)毒素耐受模型的初步建立與評(píng)價(jià)采用腹腔連續(xù)5d注射1mg/kglps并于第6d尾靜脈注射50mg/kglps,7d內(nèi)小鼠全部存活,表明模型建立基本成功;耐受模型小鼠血清tnf-α及il-6水平較50mg/kglps攻擊小鼠明顯減少;導(dǎo)致耐受小鼠100%死亡的最低大腸埃希菌數(shù)量較正常小鼠明顯減少;細(xì)菌攻擊耐受小鼠血液中ec數(shù)量較單獨(dú)細(xì)菌攻擊小鼠明顯增多。2.小鼠內(nèi)毒素耐受模型的優(yōu)化與評(píng)價(jià)⑴腹腔注射0.3、1.0及3.0mg/kglps預(yù)處理劑量?jī)H0.3mg/kglps預(yù)處理3或5d后小鼠體重及狀態(tài)基本恢復(fù),因此確定最佳建模方案為:腹腔連續(xù)3d注射0.3mg/kglps后于第4d尾靜脈注射50mg/kglps。⑵耐受模型小鼠7d內(nèi)全部存活;耐受模型小鼠血清、肺和脾tnf-α、il-6及il-1β水平較50mg/kglps攻擊小鼠明顯減少;導(dǎo)致耐受模型小鼠100%死亡的最低銅綠假單胞菌劑量較正常小鼠明顯減少。二、青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受及二次打擊模型小鼠的保護(hù)作用1.青蒿琥酯呈劑量依賴性地增加內(nèi)毒素耐受模型小鼠血清、肺和脾中tnf-α、il-6及il-1β的釋放。2.青蒿琥酯呈劑量依賴性地降低內(nèi)毒素耐受二次打擊模型小鼠的7d死亡率。3.青蒿琥酯顯著減少內(nèi)毒素耐受二次打擊模型小鼠血液、肺和脾中銅綠假單胞菌數(shù)量。三、青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受模型小鼠保護(hù)作用機(jī)制的初步研究1.體外研究(1)采用5 ng/mL LPS預(yù)處理4 h后再用100 ng/mL LPS處理細(xì)胞建立內(nèi)毒素耐受模型,模型細(xì)胞TNF-α及IL-6釋放較100 ng/mL LPS處理組細(xì)胞明顯減少。(2)青蒿琥酯呈濃度依賴性地增加內(nèi)毒素耐受模型細(xì)胞TNF-α及IL-6的釋放;AS可增加內(nèi)毒素耐受模型細(xì)胞中TLR4、TRAF6蛋白表達(dá)及NF-κB p65蛋白活化;(3)青蒿琥酯顯著減少內(nèi)毒素耐受二次打擊模型細(xì)胞內(nèi)銅綠假單胞菌數(shù)量。2.體內(nèi)研究青蒿琥酯可增加內(nèi)毒素耐受模型小鼠肺和脾中TLR4、TRAF6蛋白表達(dá)及NF-κB p65蛋白活化。結(jié)論:1.采用腹腔連續(xù)3 d注射0.3 mg/kg的LPS并于第4 d尾靜脈注射50 mg/kg的LPS能成功建立LPS耐受小鼠模型,該模型穩(wěn)定性好、重復(fù)性高,且造模周期最短、藥品消耗最少。2.青蒿琥酯可顯著提高內(nèi)毒素耐受模型小鼠致炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β的釋放;青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受二次打擊模型小鼠具有顯著的保護(hù)作用,可提高內(nèi)毒素耐受二次打擊模型小鼠對(duì)銅綠假單胞菌的清除能力。3.青蒿琥酯可顯著提高內(nèi)毒素耐受模型細(xì)胞致炎細(xì)胞因子TNF-α及IL-6的釋放;青蒿琥酯可提高內(nèi)毒素耐受二次打擊模型細(xì)胞對(duì)銅綠假單胞菌的清除能力。4.青蒿琥酯對(duì)內(nèi)毒素耐受二次打擊模型小鼠的保護(hù)作用機(jī)制可能與促進(jìn)TLR4、TRAF6蛋白表達(dá)及NF-кB p65蛋白活化有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R459.7

【參考文獻(xiàn)】

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1 郭君;王學(xué)敏;;膿毒癥基因多態(tài)性的研究近況[J];中國(guó)民族民間醫(yī)藥;2010年22期

2 許光蘭;陳平;梁勁松;以敏;王茜;歐陽(yáng)暾;羅清;文禮;;青蒿琥酯對(duì)實(shí)驗(yàn)性肺纖維化大鼠治療作用及其機(jī)理研究[J];臨床醫(yī)學(xué)工程;2009年09期

3 劉旭;;青蒿琥酯的研究進(jìn)展[J];中國(guó)新藥雜志;2006年22期

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本文編號(hào)：1413408