本文關鍵詞：外源性一氧化碳釋放分子CORM-2通過Nrf2通路抑制LPS誘導的急性炎癥反應　出處：《南京大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：一氧化碳釋放分子CORM-2可釋放一氧化碳并被證明具有抗炎作用,但其具體的抗炎機制并未明確。有研究發(fā)現(xiàn)CORM-2可以激活Nrf2信號通路,而Nrf2信號通路與機體抗炎具有密切關系,所以我們設想CORM-2抑制炎癥是否通過激活Nrf2信號通路。在體外實驗中,我們分離了野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠的腹腔巨噬細胞,比較這兩種小鼠的腹腔巨噬細胞在LPS的誘導下CORM-2對其促炎癥因子表達抑制作用的差別；在體內(nèi)實驗中,給予野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠非致死劑量的LPS,檢測肝臟組織及腦組織中,CORM-2對這兩種小鼠促炎癥因子表達抑制作用的差別,及通過HE染色檢測肝臟組織及腦組織中炎癥細胞表達數(shù)量的差別；另外,給予野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠致死劑量的LPS,比較CORM-2對這兩種小鼠生存時間的影響。實驗結果顯示,在體內(nèi)和體外實驗中CORM-2均明顯抑制了野生型小鼠促炎癥因子的表達,但并未明顯抑制Nrf2基因敲除小鼠的,并且在小鼠生存率實驗中,CORM-2大大改善了野生型小鼠的生存時間,但并未改善Nrf2基因敲除小鼠的。從這些實驗結果可以推論,一氧化碳釋放分子CORM-2通過Nrf2通路抑制LPS誘導的急性炎癥反應。第一部分一氧化碳釋放分子CORM-2通過激活Nrf2通路抑制LPS誘導的急性炎癥反應(體外實驗部分)目的：一氧化碳的抗炎作用雖已被越來越多的研究證實,但其確切的作用機制目前并不清楚。我們采用LPS刺激小鼠原代腹腔巨噬細胞建立炎癥反應模型,在體外研究CORM-2抑制炎癥與Nrf2通路的關系。方法：確立CORM-2發(fā)揮抗炎作用的最佳濃度及確定其對Nrf2通路的激活；檢測CORM-2抑制炎癥與Nrf2通路的關系：分離野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠腹腔巨噬細胞進行原代培養(yǎng),野生型小鼠所提取細胞分為以下四組：空白對照組、CORM-2組(CORM-250 μM)、LPS組(LPS, 1μg/ml)、CORM-2干預組(LPS 1μg/ml+CORM-2 50μM), Nrf2基因敲除小鼠細胞分組同前,RT-PCR法檢測野生型小鼠與Nrf2基因敲除小鼠各組促炎癥因子如TNF--α、IL-1β、IL-6及炎癥標志蛋白iNOS的表達情況。結果：CORM-2的最佳作用濃度為50 μM; CORM-2促進了Nrf2的轉核及其下游靶基因HO-1、NQO1和γ-GCSm的表達；野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠空白對照組及CORM-2組中促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及iNOS的呈低表達；野生型小鼠LPS組中TNF-α、IL-1β、IL-6及iNOS的表達量相對于空白對照組顯著增高,而LPS+CORM-2組TNF-α、IL-1β、IL-6及iNOS的表達量則較LPS組顯著下降(P0.05);Nrf2基因敲除小鼠LPS組中TNF-α、 IL-1 β、IL-6及iNOS的表達量相對于空白對照組亦顯著升高,但LPS+CORM-2組中這些促炎癥因子及iNOS的表達量并未顯著下降。結論：一氧化碳發(fā)揮抗炎作用的機理一直未被闡明,而Nrf2-ARE通路與機體氧化應激及炎癥密切相關,那么一氧化碳的抗炎作用與Nrf2-ARE通路的關系則值得我們?nèi)ヌ骄俊Ｎ覀兊捏w外實驗證明,一氧化碳釋放分子CORM-2明顯抑制了野生型小鼠LPS誘導的促炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及iNOS的表達,但CORM-2并未顯著抑制Nrf2基因敲除小鼠以上促炎癥因子的表達。由此可以推測,Nrf2是一氧化碳發(fā)揮其抗炎作用所必需的。第二部分一氧化碳釋放分子CORM-2通過激活Nrf2通路抑制LPS誘導的急性炎癥反應(體內(nèi)實驗部分)目的：在體外實驗部分,我們的實驗結果已經(jīng)證實了CORM-2必需通過Nrf2通路才能發(fā)揮其抗炎作用。為了驗證體內(nèi)實驗結果是否與體外實驗相似,我們分別給予野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠LPS處理建立小鼠膿毒癥模型,比較在給予CORM-2后野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠體內(nèi)促炎癥因子表達的情況。另外,我們還給予野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠致死劑量的LPS,比較CORM-2對這兩種小鼠生存時間的影響。方法：采用腹膜下注射LPS建立膿毒癥模型,野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠各24只,其中野生型小鼠隨機分為四組：空白對照組、CORM-2組(CORM-2 30mg/kg)、LPS組(LPS,10mg/kg)、CORM-2干預組(LPS 10mg/kg+CORM-2 30mg/kg), Nrf2基因敲除小鼠分組同前。分別于LPS注射4h,16h后處死小鼠,取肝臟及腦組織,RT-PCR法檢測肝臟及腦組織中促炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6和iNOS的表達水平；western blot法檢測肝臟組織中炎癥標志蛋白iNOS和ICAM-1的表達水平；HE染色觀察肝臟及腦組織的病理變化。死亡率實驗中,野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠各20只,每組10只,分組如下：LPS組(LPS,10mg/kg)、CORM-2干預組(LPS 10mg/kg+CORM-2 30mg/kg),注射LPS后,每6h記錄小鼠存活數(shù),共觀察48h。結果：野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠肝臟組織中空白對照組及CORM-2組中促炎癥因子IL-1β、IL-6及iNOS呈低表達；CORM-2干預后明顯降低了野生型小鼠組促炎癥因子IL-1β、IL-6及iNOS mRNA水平的表達(P0.05)；降低了iNOS和ICAM-1蛋白水平的表達(P0.05)；亦減少了肝臟組織中中性粒細胞的浸潤,但以上實驗結果在Nrf2基因敲除小鼠中并未出現(xiàn)。與肝臟組織結果類似,野生型小鼠和Nrf2基因敲除小鼠腦組織中空白對照組及CORM-2組中促炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6呈低表達；CORM-2干預后明顯降低了野生型小鼠組促炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(P0.05)；亦減少了腦組織中中性粒細胞的浸潤,但以上實驗結果也未出現(xiàn)在Nrf2基因敲除小鼠中。在死亡率實驗中,野生型小鼠LPS組在36h內(nèi)全部死亡,而CORM-2干預組則明顯降低了死亡率(P0.05),但是CORM-2預處理未明顯改善Nrf2基因敲除小鼠的死亡率。結論：一氧化碳釋放分子CORM-2可以顯著抑制膿毒癥所致肝臟及腦組織中促炎癥因子的表達及炎癥細胞的浸潤,但卻不能改善Nrf2基因敲除小鼠的炎癥反應；并且在小鼠生存率實驗中,CORM-2大大改善了野生型小鼠的生存時間,但并未改善Nrf2基因敲除小鼠的,由此可見Nrf2信號通路在一氧化碳抑制炎癥的機制中起到重要作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R459.7

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