本文關(guān)鍵詞：重組人促紅細(xì)胞生成素對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷血管新生的影響及相關(guān)機(jī)制研究

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【摘要】：創(chuàng)傷性顱腦損傷（Traumatic brain injury, TBI）是導(dǎo)致患者死亡和長期殘疾的主要病因之一，按照病理過程包括原發(fā)性損傷（Primary brain injury）和繼發(fā)性損傷（Secondary brain injury, SBI）。原發(fā)性顱腦損傷與外界直接作用有關(guān)，難以干預(yù)。SBI發(fā)生于顱腦損傷后數(shù)小時至數(shù)天，包括線粒體功能的障礙、炎性反應(yīng)和細(xì)胞壞死、凋亡等，最終導(dǎo)致腦缺血、腦梗死、腦水腫等不良預(yù)后，是顱腦損傷患者死亡和致殘的主要原因。然而，研究發(fā)現(xiàn)，約90％的TBI患者有缺血性改變，缺血缺氧又往往伴隨出現(xiàn)，所以TBI后的局部缺血缺氧就成為SBI發(fā)生、發(fā)展的主要機(jī)制之一，血管作為供血、供氧的基本結(jié)構(gòu)，血管新生的相關(guān)研究就成為科研工作者和臨床醫(yī)師的研究的熱點(diǎn)。 血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）作為一種高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，可以通過與內(nèi)皮細(xì)胞上的兩種受體KDR和Flt-1高親和力結(jié)合，一方面直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其遷移和形成官腔樣結(jié)構(gòu)；另一方面增加微血管通透性，引起血漿蛋白（主要是纖維蛋白原）外滲，并通過誘導(dǎo)間質(zhì)產(chǎn)生而促進(jìn)體內(nèi)新生血管生成。血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(Platelet endothelial celladhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)作為血管內(nèi)皮的重要標(biāo)記物，對新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記的特異性很強(qiáng)，并參與血管新生過程，可以有效地反應(yīng)血管新生的程度。 近年來的研究證實，促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EPO)對腦創(chuàng)傷、腦卒中、缺血等疾病具有保護(hù)性治療作用，但其具體機(jī)制尚不清楚。重組人促紅細(xì)胞生成素（Recombinant human erythropoietin，rhEPO）是一種通過使用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的、含有與天然分離的EPO完全相同氨基酸序列的糖蛋白，與天然EPO具有相同的生物學(xué)特性。Nakano M等人就曾通過小鼠缺血再灌注損傷模型研究得出EPO誘導(dǎo)VEGF產(chǎn)生，進(jìn)一步促進(jìn)血管生成的結(jié)論。 我們假設(shè)rhEPO的這種促血管形成作用在大鼠TBI模型中同樣適用，那么TBI后rhEPO的干預(yù)可能會成為一種新的改善腦外傷預(yù)后的治療方法。 第一部分重組人促紅細(xì)胞生成素對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠VEGF分泌及血管新生的影響 目的：通過觀察應(yīng)用促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）對大鼠TBI后，不同時間點(diǎn)挫傷灶及周圍腦組織VEGF和CD31的表達(dá)變化，探討rhEPO對TBI后血管新生的影響。 方法：成年健康雄性SD大鼠90只，隨機(jī)分為對照組（Sham組，n=6只）、顱腦損傷組（TBI組，n=42只）和rhEPO干預(yù)組（TBI-rhEPO組，n=42只）。通過改良Feeney法建立顱腦損傷（TBI）模型，按傷后留取標(biāo)本時間分為TBI-6h、TBI-24h、TBI-3d、TBI-5d、TBI-7d、TBI-10d和TBI-14d共7個亞組，每亞組各6只，用正常大鼠作為Sham組，TBI-rhEPO組造模后即刻腹腔注射rhEPO注射液(3000IU/kg)及生理鹽水（0.5mg/kg)（用作實驗第二部分對照），以后每天同一時間點(diǎn)給藥一次，Sham組及TBI組于同一時間點(diǎn)腹腔注射等量生理鹽水，直至動物被處死。于預(yù)定時間點(diǎn)行神經(jīng)功能損傷評分（NSS），每亞組隨機(jī)取三只大鼠處死后取挫傷灶及周圍腦組織通過PT-PCR檢測VEGF、CD31mRNA表達(dá)情況；剩余的3只大鼠采用HE染色觀察傷后病灶的病理變化，采用免疫組織化學(xué)方法（SP法）檢測挫傷灶及周圍腦組織中VEGF和CD31蛋白的表達(dá)情況，應(yīng)用顯微圖像分析系統(tǒng)計算陽性細(xì)胞并測定其平均光密度值。 結(jié)果：（1）RT-PCR sham組SD大鼠腦組織未檢測到VEGF及CD31mRNA明顯表達(dá)，TBI后挫傷灶及周圍腦組織VEGF、CD31mRNA的表達(dá)均在TBI-6h開始升高，至TBI-3d表達(dá)量達(dá)到峰值，隨后均呈下降趨勢，至TBI-14天表達(dá)稍減弱，但仍為高表達(dá)狀態(tài)，而VEGF、CD31mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.9239，P0.001），與TBI組比較，TBI-rhEPO組不同時間點(diǎn)大鼠腦組織VEGF及CD31mRNA表達(dá)量均明顯升高（P0.05）；（2）免疫組化sham組大鼠腦組織未檢測到VEGF及CD31蛋白的明顯表達(dá)，顱腦損傷后挫傷灶及周圍腦組織VEGF、CD31蛋白的表達(dá)均在TBI-6h開始表達(dá)，至TBI-5d至表達(dá)高峰，并持續(xù)高表達(dá)至TBI-10d，至TBI-14d稍下降，但仍處于高表達(dá)狀態(tài)。與TBI組比較，TBI-rhEPO組不同時間點(diǎn)挫傷灶及周圍腦組織VEGF和CD31蛋白表達(dá)均明顯升高（P0.05），且VEGF蛋白表達(dá)與CD31蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.9813，P0.001）；（3）神經(jīng)功能評分（NSS） sham組SD大鼠NSS評分為0分，顱腦損傷后，TBI-rhEPO組和TBI組NSS評分均隨著時間的推移而逐漸下降，但TBI-rhEPO組下降更明顯，且在TBI-24h～TBI-14d，TBI-rhEPO組NSS明顯低于TBI組，與TBI組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0．05）。 結(jié)論：顱腦損傷早期應(yīng)用rhEPO，可通過上調(diào)VEGF和CD31的表達(dá)，進(jìn)而起到對大鼠顱腦損傷的保護(hù)作用。注重于血管新生的靶向治療，可一定程度減輕挫傷灶及周圍腦組織缺血缺氧，阻止腦水腫、腦梗死等不良預(yù)后的發(fā)生發(fā)展，達(dá)到改善腦外傷預(yù)后的目的。 第二部分重組人促紅細(xì)胞生成素促進(jìn)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠血管新生的相關(guān)機(jī)制研究 目的：通過觀察予以渥曼青霉素(wortmannin)干預(yù)的TBI后大鼠損傷灶及周圍腦組織中VEGF和CD31的表達(dá)變化，探討rhEPO促進(jìn)TBI后大鼠血管新生的可能機(jī)制。 方法：42只健康雄性SD大鼠通過改良Feeney法建立TBI模型后，即刻腹腔注射重組人促紅細(xì)胞生成素（rhEPO）注射液（3000IU/kg）及wortmannin（0.5mg/kg)，以后每天同一時間點(diǎn)給藥一次，直至動物被處死，記為TBI-WM組，根據(jù)傷后處死時間隨機(jī)分為TBI-6h、TBI-24h、TBI-3d、TBI-5d、TBI-7d、TBI-10d和TBI-14d共7個亞組，每亞組各6只。于預(yù)定時間點(diǎn)行神經(jīng)功能損傷評分（NSS），每亞組隨機(jī)取三只大鼠處死后取挫傷灶及周圍腦組織通過PT-PCR檢測VEGF、CD31mRNA表達(dá)情況；剩余的3只大鼠采用HE染色觀察傷后病灶的病理變化，采用免疫組織化學(xué)方法（SP法）檢測挫傷灶及周圍腦組織中VEGF和CD31蛋白的表達(dá)情況，應(yīng)用顯微圖像分析系統(tǒng)計算陽性細(xì)胞并測定其平均光密度值。第一部分實驗中TBI組及TBI-rhEPO組作為本部分實驗對照組。 結(jié)果：（1）RT-PCR TBI-rhEPO組SD大鼠挫傷灶及周圍腦組織VEGF、CD31mRNA的表達(dá)，在TBI-6h開始升高，，至TBI-3d表達(dá)量達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢，至TBI-14d表達(dá)稍減弱，但仍為高表達(dá)狀態(tài)；與TBI-rhEPO組比較，TBI-WM組不同時間點(diǎn)大鼠腦組織VEGF及CD31mRNA表達(dá)量均明顯下降（P0.05）；（2）免疫組化TBI-rhEPO組SD大鼠腦組織VEGF和CD31的表達(dá)，在TBI-6h開始表達(dá)，TBI-5d表達(dá)量達(dá)到高峰，高表達(dá)持續(xù)至TBI-10d，至TBI-14d稍下降，但表達(dá)量仍較高，TBI-WM組不同時間點(diǎn)挫傷灶及周圍腦組織VEGF和CD31蛋白表達(dá)均明顯下降（P0.05）；（3）神經(jīng)功能評分（NSS） TBI-rhEPO組和TBI-WM組NSS均隨著時間的推移而逐漸下降，但TBI-rhEPO組下降更明顯，且在傷后24h～14d，TBI-rhEPO組NSS明顯低于TBI-WM組，與TBI-WM組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0．05）。 結(jié)論：rhEPO保護(hù)性治療作用的可能機(jī)制是：通過磷脂酰肌醇激酶-3（PI3K/Akt）途徑，上調(diào)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)腦血管新生，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
【關(guān)鍵詞】：創(chuàng)傷性顱腦損傷 血管新生 促紅細(xì)胞生成素 渥曼青霉素 磷脂酰肌醇激酶-3 血管內(nèi)皮生長因子 血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R651.15
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-14
• 引言14-18
• 參考文獻(xiàn)16-18
• 第一部分 重組人促紅細(xì)胞生成素對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠 VEGF 分泌及血管新生的影響18-51
• 1. 實驗材料18-20
• 2. 實驗方法20-26
• 3. 結(jié)果26-40
• 4. 討論40-46
• 參考文獻(xiàn)46-51
• 第二部分 重組人促紅細(xì)胞生成素促進(jìn)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠血管新生的相關(guān)機(jī)制研究51-68
• 1. 實驗材料51-52
• 2. 實驗方法52
• 3. 結(jié)果52-62
• 4. 討論62-65
• 參考文獻(xiàn)65-68
• 研究小結(jié)68-69
• 綜述69-84
• 參考文獻(xiàn)79-84
• 中英文縮略詞表84-85
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文85-86
• 致謝86-87

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1087565