豬輪狀病毒(Porcine rotavirus,PRV)是無囊膜、分節(jié)段的雙股RNA病毒,隸屬于呼腸孤病毒科,是引起幼年仔豬發(fā)生腹瀉的主要病原之一。豬輪狀病毒感染世界各地分布廣泛,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損火,故研究一種有效地抑制病毒感染的方法尤為重要。VP4蛋白是輪狀病毒粒子中最重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一,是一種中和抗原,能夠刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗病毒中和抗體,激發(fā)免疫保護(hù),在PRV的診斷及預(yù)防中具有非常重要的作用。 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GenBank所收錄的PRV JL94株VP4基因堿基序列,設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,從本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的DN30209株擴(kuò)增VP4全長基因,并成功構(gòu)建重組質(zhì)粒VP4-pMD18-To重組質(zhì)粒經(jīng)測序和分析表明：DN30209株VP4全基因長2331bp,包含完整的開放閱讀框,與參考株JL94的核苷酸同源性為99.7%,氨基酸同源性為99.5%。將VP4全長基因連接到pGEX-6P-1原核表達(dá)載體中,構(gòu)建并篩選出陽性原核表達(dá)載體重組質(zhì)粒,標(biāo)記為pGEX-6P-1-VP4。將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta宿主菌感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),獲得以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白,融合蛋白大...

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 豬輪狀病毒的研究進(jìn)展
        1.1.1 豬輪狀病毒的歷史研究背景
        1.1.2 豬輪狀病毒的流行病學(xué)特點(diǎn)
        1.1.3 豬輪狀病毒病的診斷與防治措施
    1.2 豬輪狀病毒的生物學(xué)進(jìn)展
        1.2.1 豬輪狀病毒的形態(tài)及理化性質(zhì)
        1.2.2 豬輪狀病毒的抗原及其分型
        1.2.3 豬輪狀病毒的細(xì)胞培養(yǎng)特性
    1.3 豬輪狀病毒蛋白及其功能研究
        1.3.1 豬輪狀病毒基因組的結(jié)構(gòu)特征
        1.3.2 豬輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白及作用
        1.3.3 豬輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白及其功能
    1.4 脂筏研究進(jìn)展
        1.4.1 脂筏的概念及結(jié)構(gòu)功能
        1.4.2 研究脂筏與病毒感染的常用方法
    1.5 細(xì)胞膜膽固醇在病毒感染中的作用
        1.5.1 在包膜病毒中的作用
        1.5.2 在無囊膜病毒中的作用
    1.6 研究目的及意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 病毒與細(xì)胞
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.3 菌種及載體
        2.1.4 試劑盒、工具酶及抗體試劑
        2.1.5 主要藥品及試劑
        2.1.6 主要試劑配制及儲(chǔ)存
        2.1.7 儀器及設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 豬輪狀病VP4全長基因的克隆
        2.2.2 感受態(tài)的制備
        2.2.3 重組質(zhì)粒VP4-pMD18-T質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.4 原核表達(dá)載體質(zhì)粒pGEX-6P-1-VP4的構(gòu)建
        2.2.5 重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-VP4的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.2.6 重組蛋白的純化及復(fù)性
        2.2.7 豬輪狀病毒VP4多克隆抗體的制備與鑒定
        2.2.8 膽固醇對(duì)豬輪狀病毒感染的影響實(shí)驗(yàn)
    2.3 統(tǒng)計(jì)分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 豬輪狀病毒原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.1 豬輪狀病毒VP4基因的克隆
        3.1.2 重組質(zhì)粒VP4-pMD18-T的構(gòu)建及鑒定
        3.1.3 重組質(zhì)粒pGEX-6P-1-VP4的構(gòu)建及鑒定
    3.2 融合蛋白的表達(dá)與純化
        3.2.1 融合蛋白的表達(dá)
        3.2.2 豬輪狀病毒VP4蛋白的純化
    3.3 豬輪狀病毒VP4多克隆抗體的生物活性鑒定
        3.3.1 豬輪狀病毒VP4多克隆抗體效價(jià)的檢測
        3.3.2 豬輪狀病毒VP4多抗血清的間接免疫熒光檢測
        3.3.3 豬輪狀病毒VP4多抗血.清的Western Blot檢測
    3.4 膽固醇對(duì)豬輪狀病毒感染的影響實(shí)驗(yàn)
        3.4.1 豬輪狀病毒DN30209毒株在MA104細(xì)胞上的病變
        3.4.2 膽固醇消耗對(duì)病毒感染的影響
        3.4.3 膽固醇恢復(fù)對(duì)病毒感染的影響
4 討論
    4.1 豬輪狀病毒VP4全基因的克隆與序列比較
    4.2 豬輪狀病毒VP4基因在大腸桿菌中的表達(dá)
        4.2.1 豬輪狀病毒VP4原核表達(dá)質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建
        4.2.2 重組蛋白的純化與復(fù)性
    4.3 多克隆抗體血清的制備與鑒定
    4.4 細(xì)胞膜中膽固醇對(duì)豬輪狀病毒感染MA104細(xì)胞的影響
        4.4.1 消耗細(xì)胞膜膽固醇對(duì)豬輪狀病毒感染的影響
        4.4.2 補(bǔ)充細(xì)胞膜膽固醇可使豬輪狀病毒的感染力得到恢復(fù)
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號(hào)：4031313