發(fā)布時間：2025-02-11 13:51

　　H5N1 亞型高致病禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI)是一種急性、高度接觸性的禽類傳染病,該病是由A型流感病毒引起的。血凝素HA作為禽流感病毒的主要保護性抗原,在其抗原性和致病性中發(fā)揮重要作用。啟動子是制約重組桿狀病毒在細胞中表達的主要因素之一,強啟動子的使用能夠增強外源基因的表達效率。CMV啟動子和WSSV ie1啟動子都是公認的強啟動子,在哺乳動物細胞和昆蟲細胞中各有優(yōu)勢,能夠高效啟動外源基因的表達。本課題將H5N1型禽流感病毒HA基因分別克隆到由CMV啟動和WSSV ie1啟動的含有VSV-GED、WPRE、ITRs等調(diào)控元件的兩組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體中,通過Bac-to-Bac系統(tǒng)獲得重組Bacmid DNA;通過對Sf9昆蟲細胞的轉(zhuǎn)染,收獲兩組重組桿狀病毒;利用重組桿狀病毒進一步侵染雞胚成纖維細胞,進行SDS-PAGE和Western blotting分析,比較HA基因在禽類細胞中的表達水平;將攜帶HA基因的重組桿狀病毒直接作為疫苗進行雞體免疫試驗,將目的抗原基因高效地傳遞到家禽細胞中,使其有效地刺激機體產(chǎn)生特異性保護抗體和較強的...

【文章頁數(shù)】：105 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
符號與縮略語
第1章 緒論
    1.1 禽流感病毒概況
        1.1.1 H5N1亞型禽流感的流行現(xiàn)狀
        1.1.2 AIV的形態(tài)
        1.1.3 AIV基因編碼的主要蛋白質(zhì)
        1.1.4 HA蛋白與AIV的致病性
        1.1.5 AIV的防治
    1.2 桿狀病毒表達系統(tǒng)
        1.2.1 桿狀病毒表達系統(tǒng)的優(yōu)越性
        1.2.2 桿狀病毒表達系統(tǒng)在禽流感疫苗中的應(yīng)用
    1.3 桿狀病毒的基因修飾
        1.3.1 選用合適的啟動子
        1.3.2 添加WPRE、ITRs等調(diào)控元件
    1.4 本研究的目的和意義
    1.5 本研究的實驗技術(shù)路線
        1.5.1 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建策略
        1.5.2 重組桿狀病毒的擴增和外源基因的表達
        1.5.3 重組桿狀病毒的雞體免疫試驗
    1.6 課題資助名稱
第2章 材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 供試材料
        2.1.2 擴增引物
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.1.4 主要分子生物學及生化試劑
        2.1.5 主要緩沖液及試劑配制
    2.2 試驗方法
        2.2.1 重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
        2.2.2 重組桿狀病毒穿梭載體Bacmid DNA的獲得
        2.2.3 重組桿狀病毒穿梭載體轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞
        2.2.4 重組桿狀病毒的擴增及滴度測定
        2.2.5 重組桿狀病毒在雞胚成纖維細胞中表達
        2.2.6 重組蛋白的SDS-PAGE檢測和Western-blotting鑒定
        2.2.7 間接免疫熒光檢測VSVG蛋白
        2.2.8 重組桿狀病毒的雞體免疫試驗
第3章 結(jié)果
    3.1 重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
        3.1.1 目的片段HA的克隆與鑒定
        3.1.2 pS-HA系列重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
        3.1.3 pA-HA系列重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
    3.2 重組桿狀病毒穿梭載體的鑒定
        3.2.1 重組穿梭轉(zhuǎn)移載體Bacmid-S-HA系列的鑒定
        3.2.2 重組穿梭轉(zhuǎn)移載體Bacmid-A-HA系列的鑒定
    3.3 重組桿狀病毒穿梭載體轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞
        3.3.1 Sf9昆蟲細胞生長曲線的繪制
        3.3.2 重組桿狀病毒感染Sf9細胞后的病變形態(tài)
        3.3.3 P1代重組桿狀病毒的收獲
    3.4 重組桿狀病毒的擴增及滴度測定
        3.4.1 重組桿狀病毒的PCR鑒定
        3.4.2 重組桿狀病毒的滴度測定
    3.5 重組桿狀病毒介導目的基因在雞胚成纖維細胞中的表達
        3.5.1 雞胚成纖維細胞的形態(tài)
        3.5.2 HA蛋白的SDS-PAGE及其Western-blotting鑒定
        3.5.3 重組蛋白的Western blotting分析
    3.6 間接免疫熒光檢測結(jié)果
    3.7 重組桿狀病毒的雞體免疫試驗
        3.7.1 雞外周血淋巴細胞增殖試驗
        3.7.2 雞血清中IgG抗體水平的檢測
        3.7.3 雞血清中IL-4含量的檢測
        3.7.4 雞血清中IL-2含量的檢測
        3.7.5 雞血清中IFN-γ含量的檢測
第4章 討論
    4.1 課題背景
    4.2 不同啟動子對目的蛋白HA表達的影響
    4.3 不同調(diào)控元件對目的蛋白表達的影響
    4.4 不同啟動子的重組桿狀病毒疫苗的免疫原性的影響
    4.5 不同調(diào)控元件對重組桿狀病毒疫苗免疫原性的影響
    4.6 免疫程序的選擇
第5章 結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝
攻讀碩士學位期間發(fā)表學術(shù)論文情況



本文編號：4033361