本文關(guān)鍵詞：聚乙二醇干擾素治療拉米夫定耐藥慢乙肝患者中耐藥毒株動(dòng)態(tài)變化及其與療效的關(guān)系

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【摘要】：背景與目的乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染呈全球性分布,全球約有20億人既往感染過(guò)HBV,目前全球仍有超過(guò)3.5億的慢性乙肝病毒感染者。中國(guó)是HBV感染高發(fā)地區(qū),2006年中國(guó)乙型肝炎流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明,我國(guó)乙肝表面抗原(HBsAg)攜帶率約為7.18%,其中約2000萬(wàn)例為慢性乙型肝炎患者(Chronic hepatitis B virus, CHB),這些患者可以發(fā)展為失代償性肝病、肝硬化、原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)等危及患者生命的疾病,因此HBV仍然是我國(guó)重要的社會(huì)公共問(wèn)題之一。拉米夫定因具備有效的抑制HBV的復(fù)制的能力成為第一個(gè)用于慢性乙型肝炎治療的核苷(酸)類(lèi)似物。CHB患者在LAM長(zhǎng)期治療下可以顯著降低CHB患者血清HBV DNA水平,促進(jìn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的發(fā)生,降低肝臟炎癥活動(dòng),從而延緩或阻止肝臟疾病的進(jìn)展,減少失代償肝硬化和肝癌的發(fā)生,降低CHB患者的死亡率。由于其良好的安全性和耐受性,成為許多經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)首選用于治療慢性乙型肝炎的藥物。目前耐藥成為阻礙LAM長(zhǎng)期治療的主要原因,耐藥在LAM治療下的1年、2年、3年、4年和5年的發(fā)生率分別為22%、38%、53%、66%和82%。耐藥發(fā)生后可導(dǎo)致病毒學(xué)突破或反彈,加重疾病進(jìn)展,增加肝硬化以及肝癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。因此拉米夫定治療過(guò)程中乙肝病毒耐藥的監(jiān)測(cè)以及及時(shí)的挽救治療是至關(guān)重要的。拉米夫定耐藥后的挽救治療,目前指南推薦主要是換用TDF或加用ADV。拉米夫定耐藥后加用ADV比換用ADV療效更好,并且可以減少ADV耐藥的發(fā)生率,因此指南主要推薦的拉米夫定耐藥的挽救治療策略是加用無(wú)交叉耐藥的核苷(酸)類(lèi)藥挽救物。但這種挽救治療策略將意味患者需要接受長(zhǎng)達(dá)多年的藥物治療,而且可能會(huì)導(dǎo)致多重耐藥的發(fā)生。聚乙二醇干擾素a-2a (Pegylated Interferon alfa-2a, Peg-IFNa-2a)是一種長(zhǎng)效干擾素,療效優(yōu)于普通干擾素。Peg-IFN α-2a可以通過(guò)有限的治療時(shí)間在部分患者中誘導(dǎo)持續(xù)的免疫應(yīng)答,如持續(xù)的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換,甚至HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。因此有研究提示Peg-IFN a-2a可能用做LAM耐藥的挽救治療。為了評(píng)價(jià)Peg-IFN a-2a挽救治療LAM耐藥患者的治療療效,在2005年至2008年間,我們進(jìn)行了一項(xiàng)多中心、隨機(jī)、對(duì)照臨床研究。此項(xiàng)臨床研究用于評(píng)價(jià)Peg-IFN a-2a在HBeAg陽(yáng)性的拉米夫定耐藥患者療效和安全性。結(jié)果顯示Peg-IFN a-2a在LAM耐藥患者的療效與其在初治患者療效相比,應(yīng)答不佳的比例偏高,在48周停藥后,大部分患者發(fā)生了病毒學(xué)反彈。Peg-IFNαt-2a治療LAM耐藥患者應(yīng)答與療效并未令人滿(mǎn)意,挽救治療應(yīng)答不佳的原因并不清楚,主要由宿主免疫和病毒兩方面的因素導(dǎo)致,而這兩個(gè)因素之間又存在相互作用的關(guān)系。HBV以準(zhǔn)種形式存在于感染者體內(nèi),感染者體內(nèi)的HBV準(zhǔn)種因自身的突變及復(fù)制能力的差別和宿主免疫壓力的選擇作用下發(fā)生著不斷的變化,而在核苷(類(lèi))藥物的作用下,HBV耐藥突變毒株的變化可能主要由藥物的選擇和病毒自身適應(yīng)性決定,但在Peg-IFN a-2a治療下并不存在對(duì)于病毒耐藥位點(diǎn)的選擇,因此在Peg-IFN a-2a治療下耐藥突變毒株變化可能更能反應(yīng)宿主免疫與病毒自身適應(yīng)性的變化,而目LAM耐藥患者在Peg-IFN a-2a治療下耐藥毒株的動(dòng)態(tài)變化和演變尚無(wú)報(bào)道。近年來(lái),焦磷酸測(cè)序分析的方法越來(lái)越多的應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)。該方法由于高靈敏度、準(zhǔn)確性以及高通量的特點(diǎn),也逐漸被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于HBV耐藥突變的檢測(cè)。本研究采用的基于焦磷酸測(cè)序設(shè)計(jì)的試劑盒,其可檢測(cè)10個(gè)常見(jiàn)HBV耐藥突變相關(guān)位點(diǎn)(rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236和rt250)。所以,首先我們對(duì)焦磷酸測(cè)序試劑盒進(jìn)行了性能及臨床適用性的評(píng)價(jià),隨后通過(guò)焦磷酸測(cè)序定量檢測(cè)Peg-IFN a-2a治療過(guò)程中LAM耐藥患者耐藥毒株的動(dòng)態(tài)變化,并研究耐藥毒株的演變與治療療效的關(guān)系。研究對(duì)象與方法一、 標(biāo)本來(lái)源1.焦磷酸測(cè)序試劑盒臨床驗(yàn)證標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)品102例CHB患者臨床樣本選自2011年1月至2011年12月在南方醫(yī)院肝病中心住院或門(mén)診的病人。CHB診斷符合2005年慢性乙型病毒性肝炎防治指南相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；患者使用NA治療時(shí)間6個(gè)月；在治療期間發(fā)生病毒學(xué)突破(HBVDNA水平較最低點(diǎn)上升1個(gè)log值)或生化學(xué)突破,或經(jīng)過(guò)1年以上的抗病毒治療后HBV DNA仍然高于檢測(cè)下限(≥1000 copies/ml);在南方醫(yī)院肝病中心通過(guò)PCR聯(lián)合Sanger測(cè)序分析檢測(cè)HBV耐藥,成功獲得HBV RT區(qū)序列的患者。焦磷酸測(cè)序特異性檢測(cè)采用的是中國(guó)藥品生物制品檢定所提供的HBV核酸定量標(biāo)準(zhǔn)品中的陰性參考品。PCR最低檢測(cè)下限驗(yàn)證采用世界衛(wèi)生組織HBVDNA定量標(biāo)準(zhǔn)品。含乙型肝炎病毒基因序列rt區(qū)片段、10個(gè)耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)(rt169、rt173、 rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236和rt250)均為野生型或突變型的質(zhì)粒由凱杰生物工程(深圳)有限公司提供。2.研究LAM耐藥毒株的演變及其與治療療效的關(guān)系的標(biāo)本本研究中的所有患者均來(lái)自2005年至2008年進(jìn)行的一項(xiàng)多中心、隨機(jī)、對(duì)照臨床試驗(yàn)。此項(xiàng)臨床試驗(yàn)在中國(guó)13個(gè)研究中心進(jìn)行,其中包括香港。研究開(kāi)始時(shí)共255例患者進(jìn)入隨機(jī)分組,其中聚乙二醇干擾素a-2a治療組171例,阿德福韋治療組84例。根據(jù)其應(yīng)答情況,本研究首先通過(guò)40例患者分析peg-IFN治療下耐藥毒株動(dòng)態(tài)狀態(tài)及其與治療應(yīng)答關(guān)系,其中13例患者發(fā)生完全應(yīng)答,27例無(wú)應(yīng)答患者通過(guò)年齡、性別、基線(xiàn)HBV DNA水平、基線(xiàn)HBsAg水平和HBV基因型與完全應(yīng)答患者進(jìn)行配對(duì)。而后,將所有24周血清量足夠的123例聚乙二醇干擾素a-2a治療患者用于驗(yàn)證24周耐藥毒株定量與應(yīng)答關(guān)系。二、 實(shí)驗(yàn)技術(shù)1.核酸提取使用QIAamp UltraSens Virus Kit從200 μL血清樣本中提取40 μL核酸樣品,提取步驟嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,并在提取過(guò)程中采取必要措施防止樣本間的交叉污染。2.焦磷酸測(cè)序使用Qiagen公司提供的焦磷酸測(cè)序試劑盒可檢測(cè)10個(gè)常見(jiàn)HBV耐藥突變相關(guān)位點(diǎn)：rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236和rt250。擴(kuò)增使用Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀,焦磷酸測(cè)序平臺(tái)為PyroMark(?) Q24 MDx (Qiagen,德國(guó)),測(cè)序步驟嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。三、測(cè)序數(shù)據(jù)分析采用焦磷酸測(cè)序儀配套的分析軟件,首先進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)分析判定是否有突變。若該位點(diǎn)存在雜合突變,則進(jìn)行突變株的比例分析,判斷突變病毒株在病毒準(zhǔn)種中所占的比例,再通過(guò)后期線(xiàn)性關(guān)系計(jì)算出真實(shí)突變比例。四、焦磷酸試劑盒驗(yàn)證1.PCR最低工作下限使用WHO乙型肝炎病毒核酸定量標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋系列樣品驗(yàn)證試劑盒PCR工作下限。2.線(xiàn)性范圍及準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)使用含乙型肝炎病毒基因序列rt區(qū)片段的10個(gè)耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)均為野生型或均為突變型的2個(gè)質(zhì)粒樣品制備不同突變型/野生型比例的系列樣品,重復(fù)檢測(cè)至少10次用于評(píng)價(jià)試劑盒的準(zhǔn)確性及建立突變比例真實(shí)值與檢測(cè)值的線(xiàn)性關(guān)系。3.焦磷酸測(cè)序與直接測(cè)序?qū)Ρ冗x取102例經(jīng)Sanger測(cè)序分析rt區(qū)序列的核苷(酸)類(lèi)藥物治療慢性乙型肝炎患者臨床樣本,使用焦磷酸測(cè)序試劑盒檢測(cè)分析10個(gè)HBV耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)的特征,評(píng)價(jià)兩種測(cè)序分析結(jié)果的一致性。五、臨床指標(biāo)檢測(cè)方法1.血清HBV標(biāo)志物的檢測(cè)使用商業(yè)化的試劑盒,檢測(cè)方法為Abbott Architect 12000免疫化學(xué)發(fā)光法。2.血清HBV DNA定量PCR熒光定量探針?lè)?使用使用商業(yè)化的試劑盒Cobas Amplicor HBV Monitor V2.0檢測(cè),檢測(cè)下限為60 IU/mL。3.ALT使用商業(yè)化的試劑盒,通過(guò)全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè),正常值上限為40U/L。六、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)本文中所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)(范圍)表示,率的比較用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率檢驗(yàn)分析。定量資料用兩獨(dú)立樣本非參檢驗(yàn)的Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行分析。陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、特異性、敏感性和ROC曲線(xiàn)下面積用來(lái)檢驗(yàn)預(yù)測(cè)因子預(yù)測(cè)預(yù)后的相應(yīng)預(yù)測(cè)價(jià)值,線(xiàn)性關(guān)系評(píng)價(jià)采用線(xiàn)性擬合,所有結(jié)果均采用雙側(cè)檢驗(yàn),P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果一、焦磷酸測(cè)序試劑盒驗(yàn)證焦磷酸測(cè)序試劑盒的PCR工作下限為50 IU/mL；線(xiàn)性分析提示除rt236位點(diǎn)外,其他9個(gè)耐藥位點(diǎn)的突變比例真實(shí)值與檢測(cè)值線(xiàn)性關(guān)系均達(dá)到R20.98；臨床樣本檢測(cè)結(jié)果顯示,4例樣本部分位點(diǎn)PCR擴(kuò)增失敗,98例樣本HBV DRT檢測(cè)結(jié)果與Sanger測(cè)序分析結(jié)果的總符合率達(dá)92.6%(897/969),其中10個(gè)耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)結(jié)果全部一致的樣本占46.9%(46/98)；兩種測(cè)序方法在1 0個(gè)位點(diǎn)上的一致率介于71.5%至100%；兩種測(cè)序結(jié)果不一致中,87.5%(63/72)為Sanger測(cè)序結(jié)果為野生型(WT)而HBV DRT檢測(cè)結(jié)果為野生／突變混合型(WT/MT),6.9%(5/72)為Sanger測(cè)序結(jié)果為WT而HBV DRT檢測(cè)結(jié)果為MT,5.6%(4/72)為Sanger測(cè)序結(jié)果為WT/MT而HBV DRT檢測(cè)結(jié)果為WT。二、LAM耐藥毒株的演變及其與治療療效的關(guān)系1.焦磷酸測(cè)序結(jié)果共123例Peg-IFN a-2a治療組患者納入分析,首先40例用于分析拉米夫定耐藥動(dòng)態(tài)變化的患者在0周、24周、48周、72周的焦磷酸測(cè)序成功率為100%(40/40)、82.5%(33/40)、70%(28/40)和87.5%(35/40)。隨后檢測(cè)了123例患者24周耐藥突變情況用于驗(yàn)證其與療效關(guān)系,檢測(cè)成功率為91%(112/123)。2.患者基線(xiàn)臨床特征。共123例Peg-IFN a-2a治療組患者納入分析,其中101例為男性,22例為女性,中位年齡為33歲(19～63歲),血清HBV DNA水平為7.15±1.2 log IU/mL,ALT水平為72U/L (9～1776 U/L)。其中34例為基因B型,89例為基因C型。3.基線(xiàn)耐藥突變40例患者中M204V/I、L180M、A181V和V173L各位點(diǎn)上發(fā)生突變的人數(shù)占總?cè)藬?shù)百分比分別為100%(40/40)、82.5%(33/40)、60%(24/40)和10%(4/40),該四位點(diǎn)在患者體內(nèi)突變比率中位數(shù)分別為95.8%(29.6%-100%)、80.5%(0%-97.1%)、5.9%(0%-16.8%)和0%(0%-97%)。4. Peg-IFN a-2a治療下耐藥毒株變化情況rtM204V/I總突變百分率在完全應(yīng)答組(CR)的0周、24周、48周和72周分別為91.3±19.4%、19.9±27.1%、9.1±26.4%和15.8±27.4%；無(wú)應(yīng)答組(NR)的0周、24周、48周和72周分別為90±11.3%、47.2±32.2%、31.2±29.4%和21.3±29.9%。rtL180M突變百分率在CR組的0周、24周、48周和72周分別為50+44.6%、11.2±27.1%、13.6±23.9%和13.4±25.5%；NR組的0周、24周、48周和72周分別為69.4±32.4%、31.2±29.6%、11.66±29.7%和9.2±18.9.%。rtA181V突變百分率在CR組的0周、24周、48周和72周分別為5.8±5.9%、1.3±1.3%、1.0±2.1%和2.3±2.2%；NR組的0周、24周、48周和72周分別為6.0±5.2%、4.6±2.8%、4.5±3.7%和5.3±3.2%。5.基線(xiàn)耐藥毒株突變百分率與治療療效關(guān)系基線(xiàn)rtM204V/I平均突變比率在CR組和NR組無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(91.3±19.4% vs 90±11.3%,P=0.132)�；�(xiàn)rtLl 80M平均突變比率在CR組和NR組無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(50+44.6%vs 69.4±32.4%P=0.307)�；�(xiàn)rtA181V平均突變比率在CR組和NR組無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(5.8-±-5.9%vs4.6±2.8%P=0.311)。6.24周耐藥毒株突變比率與Peg-IFN治療應(yīng)答的關(guān)系24周M204V/I、L180M和A181V等位點(diǎn)在CR組和NR組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均0.01)。40例患者24周時(shí)HBV DNA、HBsAg、M204V/I、L180M和A181V對(duì)于治療應(yīng)答的預(yù)測(cè)的ROC曲線(xiàn)下面積分別為0.866、0.872、0.771、0.781和0.862。全部123例患者的24周時(shí)HBV DNA、HBsAg、M204V/I、L180M和A181V對(duì)于治療應(yīng)答的預(yù)測(cè)的ROC曲線(xiàn)下面積分別為0.809、0.833、0.672、0.759和0.764。7.24周預(yù)測(cè)完全應(yīng)答的最佳cut-off值HBV DNA、HBsAg、M204V/I、L180M和A181V在24周預(yù)測(cè)完全應(yīng)答的最佳cut-off值分別為6 log IU/mL、 2log IU/mL、20%、5%和5%。結(jié)論1.焦磷酸試劑盒用于檢測(cè)乙肝耐藥基因具有良好的敏感性和準(zhǔn)確性,在檢測(cè)樣本中存在少量病毒突變株時(shí)優(yōu)于直接測(cè)序,可用于耐藥突變的早期檢測(cè)。2.基于本研究數(shù)據(jù),我們并未發(fā)現(xiàn)基線(xiàn)病毒耐藥毒株突變百分率與治療療效的關(guān)系,基線(xiàn)時(shí)完全應(yīng)答組和無(wú)應(yīng)答組在M204V/I、L180M、A181V等三位點(diǎn)的耐藥毒株突變百分率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,基線(xiàn)病毒耐藥毒株突變百分率并不能預(yù)測(cè)治療應(yīng)答。3.24周耐藥毒株突變比率水平的高低可預(yù)測(cè)Peg-IFN治療拉米夫定耐藥患者的療效,在全部123例患者M(jìn)204V/I、L180M和A1 81V對(duì)于治療應(yīng)答的預(yù)測(cè)的ROC曲線(xiàn)下面積分別為0.672、0.759和0.764。但預(yù)測(cè)作用最強(qiáng)的仍是HBV DNA和HBsAg水平。4.24周時(shí),耐藥毒株突變比率水平結(jié)合HBV DNA和HBsAg水平可增強(qiáng)預(yù)測(cè)效能,當(dāng)HBV DNA6 log10 IU/mL, HBsAg2 log10 IU/mL且rtA1 81V5%時(shí),其預(yù)測(cè)敏感度為84.62%,特異度為81.48%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)為68.75%,陰性預(yù)測(cè)值(NPV)為91.67%。提示在使用聚乙二醇干擾素對(duì)拉米夫定耐藥進(jìn)行挽救治療可定量檢測(cè)突變水平來(lái)增加預(yù)測(cè)效能。
【關(guān)鍵詞】：慢性乙型肝炎 焦磷酸測(cè)序 拉米夫定耐藥 聚乙二醇干擾素 YMDD突變
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-22
• 第一章 研究背景22-31
• 第一節(jié) 乙肝與耐藥22-23
• 第二節(jié) HBV耐藥突變定義及機(jī)制23-25
• 第三節(jié) HBV突變檢測(cè)方法25-27
• 第四節(jié) 焦磷酸測(cè)序27-28
• 第五節(jié) 拉米夫定耐藥挽救治療28-29
• 第六節(jié) 聚乙二醇干擾素用于核苷類(lèi)藥物耐藥挽救治療29-31
• 第二章 焦磷酸測(cè)序試劑盒性能評(píng)價(jià)及臨床適用性31-46
• 第一節(jié) 材料和方法31-39
• 1.1 研究對(duì)象31-32
• 1.2 標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)源32
• 1.3 試劑與儀器32-33
• 1.4 核酸提取33-34
• 1.5 焦磷酸測(cè)序34-38
• 1.6 臨床樣本耐藥檢測(cè)38
• 1.7 統(tǒng)計(jì)分析38-39
• 第二節(jié) 結(jié)果39-43
• 1.1 HBV DRT試劑盒性能評(píng)價(jià)39-41
• 1.2 臨床樣本結(jié)果41-43
• 第三節(jié) 討論43-46
• 第三章 Peg-IFN α-2a治療LAM耐藥HBeAg陽(yáng)性CHB中耐藥突變毒株變化及其與療效的關(guān)系46-64
• 第一節(jié) 材料和方法47-50
• 1. 標(biāo)本來(lái)源和研究設(shè)計(jì)47-49
• 2. 血清HBV DNA的抽提49
• 3. 焦磷酸測(cè)序49
• 4. 臨床指標(biāo)49-50
• 5. 統(tǒng)計(jì)分析50
• 第二節(jié) 研究結(jié)果50-61
• 1. 患者基線(xiàn)臨床特征50-51
• 2. 焦磷酸測(cè)序結(jié)果51
• 3. 基線(xiàn)耐藥突變51-53
• 4. Peg-IFN α-2a治療下耐藥毒株變化情況53-56
• 5. rtL180M與rtM204V相關(guān)性分析56-58
• 6. 耐藥毒株突變動(dòng)態(tài)變化與治療療效關(guān)系58-61
• 第三節(jié) 討論61-64
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 中英文縮略詞對(duì)照表69-70
• 攻讀碩士學(xué)位期間撰寫(xiě)的論文70-71
• 致謝71-72

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 劉玲;李從榮;鄭毅;趙友云;;巢式PCR聯(lián)合焦磷酸測(cè)序檢測(cè)乙肝病毒耐藥基因的方法建立和初步臨床應(yīng)用[J];中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志;2013年03期

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本文編號(hào)：671265