本文關(guān)鍵詞：巨片形吸蟲病診斷抗原的篩選及相關(guān)重組蛋白的診斷價值評價，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]本研究采用巨片形吸蟲病患者血清免疫學(xué)篩選巨片形吸蟲(Fasciola.gigantica F.g)成蟲的cDNA表達文庫,尋找巨片形吸蟲病血清學(xué)診斷的候選抗原,選擇巨片形吸蟲特異基因進行克隆和表達,并評估重組蛋白的診斷價值。[方法]本文以采集自云南大理農(nóng)貿(mào)市場牛肝膽管內(nèi)的Eg成蟲為材料(通過形態(tài)學(xué)鑒定及cox1、ITS1-2間隔區(qū)和nadl等分子鑒定確認(rèn)蟲種為Eg),提取成蟲總RNA,并進一步純化為mRNA,構(gòu)建λZAPⅡ cDNA表達文庫；用巨片形吸蟲病患者混合血清篩選cDNA表達文庫,獲得陽性克隆。將陽性克隆進行測序,并且經(jīng)過BLAST比對等生物信息學(xué)分析篩選候選診斷抗原基因；將獲得的目的基因擴增,構(gòu)建重組質(zhì)粒,進行原核表達與純化；用間接ELISA方法評價重組蛋白的診斷價值。[結(jié)果]從巨片形吸蟲cDNA文庫初步篩選到56個陽性克隆,經(jīng)過二篩、三篩以及正常人血清復(fù)篩后最終獲得19個陽性克隆,經(jīng)DNA序列測序,通過BLAST分析比對,除去線粒體基因及與其他物種高同源性基因,剩余的11個基因共分為4大類,分別為組織蛋白酶L蛋白(CL)、硫氧還蛋白過氧化物酶(TPx)、鞘脂激活蛋白樣蛋白2(SAP2)和卵黃蛋白B2(VB2),其中TPx、SAP2和VB2在以往報道中未見對人體巨片形吸蟲病診斷的深入研究,故將TPx、SAP2和VB2進行一步研究。三類重組蛋白均成功表達并純化,通過間接ELISA法對三類重組蛋白的免疫反應(yīng)性進行檢驗,結(jié)果顯示TPx和SAP2的表達產(chǎn)物有較好的免疫反應(yīng)性。以純化并復(fù)性的rFgTPx_nt重組蛋白為檢測抗原,通過間接ELISA方法檢測巨片形吸蟲病患者血清中的特異性抗體,該ELISA法的敏感性為66.7%,特異性為96.8%,總體符合率87.6%,與血吸蟲病人、華支睪吸蟲病人血清交叉反應(yīng)率分別為0.0%(0/15)和6.7%(1/15)；治療前后血清OD值分別為0.233±0.088和0.129±0.072,二者存在明顯差異(P0.05),表明該抗原具有療效考核的價值。以rFgSAP2重組蛋白和F.g ESA分別作為包被抗原檢測巨片形吸蟲病患者血清,SAP2-ELISA法的敏感性為100%,特異性為94.8%,總體符合率95.8%；與血吸蟲病、囊蟲病、華支睪吸蟲病和麝貓后睪病患者血清無交叉反應(yīng),但與并殖吸蟲病患者血清存在較高的的交叉反應(yīng)(46.1%,6/13)。FgESA-ELISA法的結(jié)果與SAP2的結(jié)果基本一致,但與并殖吸蟲病患者血清無反應(yīng)。實驗表明：rFgSAP2重組蛋白對巨片形吸蟲病具有極高的診斷價值。另外,rFgTPx_nt和rFgSAP2重組蛋白均可識別巨片形吸蟲病急性期患者血清,表明該兩種抗原具有早期診斷價值。[結(jié)論]本研究使用巨片形吸蟲病患者血清免疫學(xué)篩庫得到4類抗原,成功表達TPx、SAP2和VB2三類重組蛋白；通過間接ELISA法進行檢測,顯示rFgTPx_nt和rFgSAP2重組蛋白有較高的免疫反應(yīng)性,且皆可用于早期診斷,rFgTPx_nt重組蛋白具有考核療效作用,rFgSAP2重組蛋白具有極高的診斷價值。
【關(guān)鍵詞】：巨片形吸蟲 cDNA文庫 免疫篩選 重組表達 ELISA
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R532.21
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 前言10-14
• 第一部分 巨片形吸蟲病診斷候選抗原基因的篩選與克隆14-44
• 引言14
• 材料與方法14-26
• 結(jié)果26-42
• 小結(jié)42-44
• 第二部分 巨片形吸蟲診斷候選抗原的原核表達及純化44-64
• 引言44
• 材料與方法44-54
• 結(jié)果54-62
• 小結(jié)62-64
• 第三部分 重組蛋白的診斷價值的評估64-76
• 引言64
• 材料與方法64-68
• 結(jié)果68-75
• 小結(jié)75-76
• 討論76-80
• 結(jié)論80-82
• 參考文獻82-84
• 致謝84-86
• 附件1 (發(fā)表的論文)86-91
• 附件2 (發(fā)表的綜述)91-95

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本文編號：423822