本文關鍵詞：基于HIV-1 4E10表位分支肽免疫原制劑處方的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：開發(fā)艾滋病疫苗是全球面臨的重要任務和挑戰(zhàn)，盡管艾滋病病毒已發(fā)現(xiàn)30多年，但由于其多變和多樣性，迄今還沒有一種針對該病的疫苗能投入使用。人類免疫缺陷病毒（HIV）包膜蛋白gp41近膜外區(qū)（MPER）是多種HIV廣譜中和抗體（4E10，，2F5，Z13和10E8）的靶點，在HIV疫苗研究中深受關注。 當HIV病毒感染細胞時，MPER會發(fā)生一系列的構(gòu)象變化，短暫暴露出的表位可以被免疫系統(tǒng)識別并產(chǎn)生應答反應，同時該區(qū)域也是抗體發(fā)揮中和作用的關鍵部位。盡管與線性多肽共結(jié)晶的結(jié)果表明，4E10所識別MPER核心表位構(gòu)象為-helical結(jié)構(gòu)，但通過構(gòu)象約束模擬含有該表位的各種免疫原均未能誘導出廣譜中和抗體，并且到目前MPER構(gòu)象仍不完全確定。2013年，ZhangLS等人基于HIV2F5和4E10所識別的保守性表位，通過剛性的賴氨酸核心和柔性的6-氨基己酸連接，設計了一種剛?cè)釀討B(tài)平衡的HIV2F5和4E10四分支肽免疫原（2F5MAP4和4E10MAP4），免疫活性研究和中和評價結(jié)果顯示4E10MAP4免疫原可以誘發(fā)豚鼠血清產(chǎn)生針對HIV BC (73%positive)、C (93%positive)、B(20%positive)和AE (30%positive)亞型假毒的中和活性。Matthew R. Gardner等人在2015年《Nature》報道，eCD4-Ig通過緊密結(jié)合HIV表面兩個不變的位點，可阻止部分已知HIV毒株感染。這兩項研究成果為HIV疫苗研究開辟了一個新的參考方向。 基于4E10MAP4在豚鼠體內(nèi)可誘導產(chǎn)生針對已知HIV假毒廣譜中和活性的研究結(jié)果，本論文開展該免疫原臨床制劑處方研究。通過溶解介質(zhì)選擇，免疫次數(shù)，免疫劑量，佐劑篩選，研究4E10MAP4制劑處方組成和免疫程序；通過評價佐劑吸附，制劑穩(wěn)定性，研究4E10MAP4制劑處方相關質(zhì)量標準。論文擬為艾滋病侯選疫苗4E10MAP4制劑的中試生產(chǎn)工藝和臨床研究提供必要支持。 依據(jù)前期4E10MAP4免疫原的質(zhì)量研究，本論文以高效液相色譜（HPLC）、質(zhì)譜（MS）和小分子蛋白電泳（TricineSDS-PAGE）對免疫原純度和分子量進行質(zhì)量復檢；ELISA方法確認免疫原表位的正確性。為獲得4E10-MAP4的最佳免疫效果，選擇免疫次數(shù)、劑量和佐劑三個有關因素開展相關研究，確定4E10-MAP4最佳免疫條件和制劑處方組成。實驗結(jié)果證明：1）4E10-MAP4免疫原分子量、純度和表位正確性均符合質(zhì)量標準；2）1M醋酸能夠完全溶解4E10-MAP4免疫原；3）隨著免疫次數(shù)增加，在第四次免疫后效價可達104以上；4）氫氧化鋁佐劑輔助4E10-MAP4的免疫效果優(yōu)于MF59；5）中劑量組（50μg/只）優(yōu)于低劑量和高劑量組（小鼠）。雖然MF59在流感疫苗中具有很強的免疫調(diào)節(jié)作用，但不能使4E10-MAP4發(fā)揮最有效的免疫應答，不過有趣的是MF59在長效免疫中發(fā)揮了較明顯的優(yōu)勢。豚鼠實驗也顯示了相同的結(jié)果。由以上數(shù)據(jù)可得：從安全性和有效性選擇1M醋酸為4E10-MAP4免疫原的溶解介質(zhì)，氫氧化鋁為制劑處方的組成，小鼠（50μg/只）和豚鼠（100μg/只）皮下四次免疫為最佳免疫條件。 接下來開展制劑處方相關質(zhì)量標準研究，首先考察了氫氧化鋁佐劑pH值、磷酸鹽、濃度及作用時間對4E10-MAP4吸附率的影響；其次對制劑有效成分進行檢定，包括解離后免疫原抗原性和制劑疫苗效果（動物實驗）；最后評價了制劑的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示：1）佐劑pH值對吸附率沒有顯著影響，而經(jīng)0.05M磷酸根處理后的佐劑吸附率可達85%，鋁含量僅需1mg，作用時間為2h；2）制劑成品經(jīng)1M醋酸冷凍4h即可完全解離，Western blotting和ELISA驗證了4E10-MAP4免疫原在解離過程中未發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的改變，皮下四次免疫小鼠后可產(chǎn)生特異性抗體，效價可達104以上；3）制劑在6±2℃貯存五周后穩(wěn)定性良好。 綜上所述，基于4E10MAP4免疫原在豚鼠體內(nèi)可誘導產(chǎn)生針對已知HIV假毒廣譜中和活性，本論文以4E10-MAP4免疫原為研究對象，研究了制劑處方組成、最佳免疫程序和相關質(zhì)量標準，為艾滋病侯選疫苗4E10MAP4制劑的中試生產(chǎn)工藝和臨床研究提供必要支持。
【關鍵詞】：HIV-1 MPER 分支肽免疫原 免疫活性 制劑處方
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R512.91
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略詞表8-12
• 第一章 緒論12-29
• 第一節(jié) HIV 背景介紹12-19
• 1.1.1 HIV 病毒簡介12-13
• 1.1.2 HIV 疫苗研究現(xiàn)狀13-15
• 1.1.3 HIV 廣譜中和抗體15-19
• 第二節(jié) 免疫佐劑19-27
• 1.2.1 免疫佐劑簡介19-21
• 1.2.2 免疫佐劑作用機制21-22
• 1.2.3 獲批用于人體的佐劑22-27
• 1.2.3.1 鋁鹽佐劑22-24
• 1.2.3.2 乳化劑 MF5924-26
• 1.2.3.3 單磷酰酯 A-MPL26-27
• 第三節(jié) 立題依據(jù)及實驗方案27-29
• 第二章 制劑處方組成及最佳免疫程序研究29-49
• 第一節(jié) 實驗材料29-33
• 2.1.1 多肽合成29
• 2.1.2 主要試劑29-30
• 2.1.3 主要儀器30-31
• 2.1.4 試劑配方31-32
• 2.1.5 實驗動物32-33
• 第二節(jié) 實驗方法33-37
• 2.2.1 多肽配制及質(zhì)量表征33-34
• 2.2.2 MF5 佐劑配制與鑒定34-35
• 2.2.3 動物免疫35
• 2.2.4 動物采血35
• 2.2.5 ELISA 檢測35-36
• 2.2.6 抗體分型36
• 2.2.7 統(tǒng)計學處理方法36-37
• 第三節(jié) 實驗結(jié)果與討論37-48
• 2.3.1 多肽原液溶解介質(zhì)的選擇37-38
• 2.3.2 確定多肽純度和分子量38-39
• 2.3.3 分子水平驗證多肽表位正確性39-40
• 2.3.4 MF59 佐劑質(zhì)量表征40-41
• 2.3.5 分支肽免疫原免疫原性41-46
• 2.3.6 討論46-48
• 第四節(jié) 小結(jié)48-49
• 第三章 制劑處方相關質(zhì)量標準研究49-63
• 第一節(jié) 材料、試劑和儀器49-51
• 3.1.1 多肽合成、試劑和材料49-50
• 3.1.2 試劑配方50
• 3.1.3 主要儀器與設備50-51
• 第二節(jié) 實驗方法51-54
• 3.2.1 多肽吸附51
• 3.2.2 多肽解離51-52
• 3.2.3 蛋白免疫印跡和 ELISA52-53
• 3.2.4 動物免疫和采血53-54
• 第三節(jié) 實驗結(jié)果54-62
• 3.3.1 臨床制劑處方相關質(zhì)量研究54-57
• 3.3.1.1 原液膜吸附率研究54
• 3.3.1.2 氫氧化鋁 pH 值對多肽吸附率影響54-55
• 3.3.1.3 氫氧化鋁磷酸鹽對多肽吸附率影響55-56
• 3.3.1.4 佐劑濃度研究56-57
• 3.3.1.5 吸附時間對多肽吸附率的影響57
• 3.3.2 制劑成品檢定研究57-60
• 3.3.2.1 制劑有效成分解離57-58
• 3.3.2.2 制劑有效成分抗原性檢定58-59
• 3.3.2.3 制劑效價測定59-60
• 3.3.3 制劑穩(wěn)定性研究60-62
• 第四節(jié) 小結(jié)62-63
• 結(jié)論63-64
• 參考文獻64-71
• 作者簡歷71-72
• 致謝72

【共引文獻】

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本文編號：421387