本文關(guān)鍵詞：白藜蘆醇對(duì)HCV增殖影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：HCV感染是日益受到關(guān)注的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題，是慢性肝臟疾病的主要病因之一。近1.3-1.7億的人口是慢性HCV感染者，占世界人口的2-3%。慢性HCV感染者，20年后進(jìn)展為肝硬化的概率為4-24%，30年后罹患原發(fā)性肝癌的概率為1 3%。HCV治療隨著對(duì)HCV基因組和分子病毒學(xué)領(lǐng)域的深入研究而取得了新的進(jìn)展，HCV蛋白酶抑制劑（DAA）的出現(xiàn)更是將該領(lǐng)域的研究推向巔峰。自2011年9種DAA藥物的上市，在HCV治療上，獲得高達(dá)≥90%持續(xù)的病毒學(xué)應(yīng)答率（SVR）突破性的進(jìn)展,且有較小的副作用；然而，高額的治療費(fèi)用仍是限制大多數(shù)新興的DAA藥物應(yīng)用的重要因素，大部分急需治療的患者不能及時(shí)用藥導(dǎo)致病毒清除的失敗。雖然在過(guò)去的10余年，HCV感染的治療取得了很多突破性的進(jìn)展，但目前仍未有獲得審批的疫苗，同時(shí)DAA藥物的高額費(fèi)用限制了DAA藥物的使用，這使新的治療手段的開(kāi)發(fā)尤為必要。 白藜蘆醇(RVT)是一種存在于多種植物及水果中的多酚類化合物。研究表明，這種酚類合成物是長(zhǎng)壽基因（sirtuin）的強(qiáng)效激活劑，該基因與壽命的長(zhǎng)短有關(guān)，同時(shí)被認(rèn)為是飲用紅酒時(shí)產(chǎn)生多酚類化合物中最為有益的成分，也被稱為：法國(guó)悖論（法國(guó)人酷愛(ài)美食，平時(shí)飲食中攝取大量高卡路里和高膽固醇的食物，但得心血管疾病的幾率卻比英語(yǔ)國(guó)家的人要低得多）。多酚白藜蘆醇分子中含有亞甲基橋隔開(kāi)的兩個(gè)苯環(huán)的分子，是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)能夠通過(guò)刺激的SIRT分泌發(fā)揮作用。Sirtuins1-7（SIRT1-7）屬于第三類脫乙�；�，它依賴于NAD+的發(fā)揮活化作用。 SIRT可以參與基因抑制，代謝控制，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活，DNA修復(fù)，神經(jīng)保護(hù)和老齡化等調(diào)節(jié)作用。到目前為止研究最廣泛的一直是SIRT1。 AMPK和SIRT1是構(gòu)成RVT的兩個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。RVT可以抑制線粒體ATP生產(chǎn)，導(dǎo)致了更高的AMP/ATP比和AMPK的LKB1依賴性活化。然后，AMPK可以提高NAD+供應(yīng)，該輔因子能夠提高SIRT1的酶活性，從而改善速率限制。本研究的目的旨在探討白藜蘆醇對(duì)HCV繁殖周期的影響。據(jù)報(bào)道，白藜蘆醇有抗腫瘤、抗炎癥、抑制肥胖以及抗細(xì)菌的特性，同時(shí)又具有保護(hù)心血管系統(tǒng)的功能。白藜蘆醇在非酒精性肝臟疾病中具有升高炎癥因子的作用。此外，前期研究表明白藜蘆醇可以抑制人類巨細(xì)胞病毒（HCMV）、單純皰疹病毒(HSV-1)、水痘-帶狀皰疹病毒和甲型流感病毒的復(fù)制。 在本研究中使用huh7.5.1細(xì)胞系來(lái)完成實(shí)驗(yàn)，首先對(duì)白藜蘆醇的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，在兩個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加0ug/ml、1ug/ml、3ug/ml、5ug/ml、6ug/ml、7ug/ml、8ug/ml、10ug/ml、13ug/ml，其中一個(gè)培養(yǎng)基培養(yǎng)48h、另一個(gè)培養(yǎng)96h，之后用MTT試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)0-5ug/ml時(shí),細(xì)胞大多數(shù)都有活性，然而6-13ug/ml時(shí)細(xì)胞死亡明顯，因此白藜蘆醇通過(guò)評(píng)價(jià)，最終選擇出沒(méi)有細(xì)胞毒性的劑量。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)衍生的HCV顆粒（HCVcc）中的JCR-2a進(jìn)行研究，JCR-2a是一種新穎的單順?lè)醋雍ＤI熒光素酶受體病毒，這種病毒是通過(guò)HCV2a型轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Jc1后得到。JCR-2a標(biāo)記的HCV顆�？梢栽隗w外存在，因此，是一種廣泛使用丙型肝炎病毒完整的復(fù)制周期模型。首先，將JCR-2a轉(zhuǎn)染細(xì)胞，4h后加不同濃度（0、1、3、5ug/ml）的白藜蘆醇,繼續(xù)培養(yǎng)72h,向細(xì)胞培養(yǎng)基中加底物（底物和單順?lè)醋雍ＤI熒光素酶結(jié)合后會(huì)發(fā)出熒光），檢測(cè)熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析細(xì)胞內(nèi)JCR-2a復(fù)制情況，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)四組中無(wú)明顯差異。其次，提取上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的上清液體(內(nèi)含有白藜蘆醇和JCR-2a)，并分別將上清液體感染新的Huh7.5.1細(xì)胞系，培養(yǎng)72h，加入底物檢測(cè)熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)四組有明顯差異，白藜蘆醇濃度越高，越容易影響病毒對(duì)細(xì)胞的感染能力。由于以上實(shí)驗(yàn)不能明確白藜蘆醇對(duì)于細(xì)胞釋放HCV的影響，設(shè)計(jì)了下一步實(shí)驗(yàn)，選擇Jc1病毒轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞系，4h后加不同濃度的白藜蘆醇（0ug/ml、1ug/ml、3ug/ml、5ug/ml），，繼續(xù)培養(yǎng)48h,用ELISA的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的丙肝病毒核心蛋白，發(fā)現(xiàn)四組中細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外沒(méi)有明顯影響。同時(shí)應(yīng)用Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的丙肝病毒核心蛋白，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明四組無(wú)明顯影響。再次，為了進(jìn)一步證實(shí)白藜蘆醇對(duì)病毒進(jìn)入細(xì)胞的影響，第一部分：將不同濃度的白藜蘆醇（0ug/ml、1ug/ml、3ug/ml、5ug/ml）加入培養(yǎng)Huh7.5.1細(xì)胞的培養(yǎng)基4h后，去除上清中白藜蘆醇，向內(nèi)加入JCR-2a，培養(yǎng)4h后去除上清，加入新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h,檢測(cè)熒光強(qiáng)度無(wú)明顯影響。第二部分：將不同濃度的白藜蘆醇（0ug/ml、1ug/ml、3ug/ml、5ug/ml）和JCR-2a同時(shí)加入培養(yǎng)Huh7.5.1細(xì)胞的培養(yǎng)基4h后，去除上清中白藜蘆醇和JCR-2a，加入新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h,檢測(cè)熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)影響明顯。第三部分，先加JCR-2a加入培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h,去除上清液，將不同濃度的白藜蘆醇（0ug/ml、1ug/ml、3ug/ml、5ug/ml）加入培養(yǎng)Huh7.5.1細(xì)胞的培養(yǎng)基48h后，檢測(cè)熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)無(wú)影響。最后，本實(shí)驗(yàn)中選擇了一個(gè)新的細(xì)胞系Huh7.5.1-VISI，該細(xì)胞系感染病毒后會(huì)發(fā)出綠色熒光。將JCR-2a轉(zhuǎn)染Huh7.5.1-VISI細(xì)胞系，培養(yǎng)4H后去除上清，向內(nèi)加入瓊脂糖凝膠72h后用熒光顯微鏡觀察空斑，然后去除瓊脂糖凝膠，用NS5A抗體進(jìn)行染色，用普通顯微鏡計(jì)數(shù)空斑個(gè)數(shù)。各種實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,白藜蘆醇可以通過(guò)損害病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的能力來(lái)抑制丙肝病毒復(fù)制，但對(duì)HCV RNA的翻譯或復(fù)制沒(méi)有影響，我們還通過(guò)ELISA的方法進(jìn)一步證實(shí)白藜蘆醇對(duì)丙肝病毒核心蛋白的裝配和釋放沒(méi)有影響。丙肝病毒感染細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程,涉及至少4種細(xì)胞因子(CD81, SR-B1, claudin-1occludin)。丙肝病毒的入侵、擴(kuò)散和繁殖在丙肝病毒感染中起重要作用，這也是丙肝治療的指征。另外實(shí)驗(yàn)表明,通過(guò)白藜蘆醇預(yù)處理的Huh7.5.1細(xì)胞并不影響HCV的感染過(guò)程。另一方面，我們通過(guò)用最大有效劑量白藜蘆醇和病毒進(jìn)行同時(shí)處理該細(xì)胞系，結(jié)果證實(shí)了白藜蘆醇抑制HCV是通過(guò)損害病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的過(guò)程。
【關(guān)鍵詞】：丙型肝炎病毒 白藜蘆醇 抗病毒
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R512.63
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• Abstract9-12
• Abbreviations12-15
• 1. Chapter 1: Introduction15-28
• 1.1. Hepatitis C Virus as a pathogen15-20
• 1.1.1. Identification of non-A non-B hepatitis (NANB)15
• 1.1.2 Epidemiology and worldwide distribution15
• 1.1.3 HCV genotype distribution:15-17
• 1.1.4 Diagnosis17-19
• 1.1.5 Clinical manifestations19-20
• 1.2 Molecular Biology of HCV20-24
• 1.2.1 HCV genome organization and encoded proteins20-22
• 1.2.2 Structure and function of the viral proteins22-24
• 1.3 The HCV life cycle24-27
• 1.3.1. Cellular receptors and HCV entry25-26
• 1.3.2 HCV RNA translation, polyprotein processing and replication:26
• 1.3.3. Virus assembly and release:26-27
• 1.4 HCV treatment27-28
• 2. Chapter 2: Aim of the study28-31
• 2.1 Resveratrol29-31
• 3. Chapter 3: Materials and methods31-35
• 3.1 Compounds and reagents31
• 3.2 Plasmids and Viruses31
• 3.3 Cell Culture and virus preparation31
• 3.4 In Vitro Transcription31-32
• 3.5 Electroporation32
• 3.6 Luciferase Infection Assay32
• 3.7 MTT analysis32-33
• 3.8 Enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) and Cell lysate preparation33
• 3.9 Western blot33
• 3.10 Quantification of HCV infection and replication33
• 3.11 TCID50 assay33-34
• 3.12 Time of addition assay34
• 3.13 Plaque assay34
• 3.14 Statistical analysis34-35
• 4. Chapter 4: Results35-44
• 4.1 Cytotoxicity of Resveratrol35
• 4.2 Resveratrol does not Inhibit HCV RNA Replication:35-36
• 4.3 Resveratrol inhibits HCV infectivity:36-37
• 4.4 Resveratrol has no effect on assembly and release37-39
• 4.5 Resveratrol impedes HCV cell entry39-41
• 4.6 Resveratrol inhibited the number of plaque formation41-44
• 5 Chapter 5: Discussion44-46
• 6 Chapter 6: References46-51
• Acknowledgements51-52
• AUTHOR INFORMATION52

【共引文獻(xiàn)】

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10 楊毅;EPC抗氧化應(yīng)激通路Nrf2/ARE對(duì)鯉春病毒的響應(yīng)[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：白藜蘆醇對(duì)HCV增殖影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：366886