本文關(guān)鍵詞：布魯氏菌TIR結(jié)構(gòu)域蛋白TcpB影響TLR通路的分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：布魯氏菌病(簡(jiǎn)稱布病)是由布魯氏菌引起的一種在全球范圍內(nèi)廣泛流行的人畜共患傳染病。布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存和復(fù)制引起的慢性感染是其主要毒力特征。布魯氏菌四型分泌系統(tǒng)(T4SS)是一種能夠分泌細(xì)菌毒力因子的多蛋白復(fù)合物，它可以將布魯氏菌蛋白(又叫效應(yīng)子)轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞，這些效應(yīng)子對(duì)于易感宿主細(xì)胞內(nèi)布魯氏菌的生存和繁殖至關(guān)重要。布魯氏菌TIR結(jié)構(gòu)域蛋白(TcpB)是T4SS底物之一，它能夠以多種方式破壞宿主的天然免疫應(yīng)答，其中一種重要的方式是通過(guò)其所包含的生長(zhǎng)素受體(TIR)結(jié)構(gòu)域競(jìng)爭(zhēng)性抑制Toll樣受體(TLRs)與下游接頭蛋白TIR結(jié)合，然而TcpB通過(guò)TIR結(jié)構(gòu)域影響宿主天然免疫應(yīng)答的機(jī)制目前尚不清楚。 本研究設(shè)計(jì)和合成了TcpB TIR結(jié)構(gòu)域表面不同區(qū)域位置的13個(gè)短肽，探討這些短肽對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)的影響。首先分別從mRNA、蛋白質(zhì)水平體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)短肽處理后的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)，從而找到對(duì)TLR4介導(dǎo)的細(xì)胞因子具有顯著抑制作用的短肽，發(fā)現(xiàn)重要的分子結(jié)構(gòu)。其次檢測(cè)短肽對(duì)TLR4介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路活性的影響，并從細(xì)胞整體水平對(duì)短肽的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測(cè)，從而為進(jìn)一步了解TcpB的作用機(jī)制提供依據(jù)。 1TcpB短肽對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)和分泌的影響 本研究以RAW264.7細(xì)胞和C57BL/6J小鼠為模型，將短肽分子孵育細(xì)胞或小鼠腹腔注射后，，檢測(cè)細(xì)胞因子mRNA和蛋白質(zhì)在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥模型中的表達(dá)水平，評(píng)價(jià)TcpB短肽對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)和分泌的影響。 mRNA水平檢測(cè)結(jié)果顯示，LPS刺激80min后，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比細(xì)胞所有檢測(cè)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)明顯升高，短肽TF-8,9處理后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞較陰性對(duì)照組細(xì)胞MyD88依賴細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6)和非依賴細(xì)胞因子(IFN-γ)mRNA的表達(dá)均出現(xiàn)顯著的抑制作用；蛋白質(zhì)水平體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，LPS刺激后，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞因子的分泌均顯著增加，TF8處理后這種增加均得到明顯抑制，TF9對(duì)IL-1和IFN-γ也出現(xiàn)明顯的抑制，但其抑制作用不如TF8明顯；蛋白質(zhì)水平體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示LPS刺激后，陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，小鼠血清中細(xì)胞因子表達(dá)顯著增加，TF8,9實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ的分泌較陰性對(duì)照組均出現(xiàn)明顯抑制作用，且TF8的抑制作用強(qiáng)于TF9。結(jié)果表明，TIR結(jié)構(gòu)區(qū)域中DD, αD, DE, βE在其免疫抑制過(guò)程中發(fā)揮重要作用，尤其是DDloop，即便單獨(dú)出現(xiàn)也能起到抑制細(xì)胞因子分泌的作用，且這種抑制是通過(guò)MyD88依賴和MyD88非依賴兩種途徑。 2TcpB短肽對(duì)NF-κB信號(hào)通路活性的影響 本研究用短肽分子孵育細(xì)胞后，westernblot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)I-κB在LPS誘導(dǎo)的炎癥模型中的表達(dá)水平變化，評(píng)估TcpB短肽對(duì)NF-κB信號(hào)通路的活性影響。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組細(xì)胞與空白對(duì)照組相比I-κB的表達(dá)明顯減少，這是由于NF-κB信號(hào)通路的激活導(dǎo)致的I-κB磷酸化而降解引起的，短肽TF2,3,4,5,8,9,10,11,12,13實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞較陰性對(duì)照組I-κB表達(dá)明顯增加，說(shuō)明這些短肽能夠抑制NF-κB信號(hào)通路激活。 3TcpB短肽的細(xì)胞毒性 采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測(cè)短肽對(duì)細(xì)胞的毒性。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組TF1,5,7,8較陰性對(duì)照組有明顯的細(xì)胞毒性，但是對(duì)照短肽TF0也出現(xiàn)細(xì)胞毒性，且與TF1,5,7,8無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。推測(cè)短肽分子的這種細(xì)胞毒性可能是由于其作為一種小分子蛋白干擾細(xì)胞內(nèi)特定的細(xì)胞代謝而引起的，TcpB蛋白所表現(xiàn)出的細(xì)胞毒性可能與TcpB氨基酸序列翻譯后的折疊、修飾等有關(guān)，單獨(dú)的某一段結(jié)構(gòu)區(qū)域并不能夠表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。 綜上所述，短肽TF8和TF9能夠通過(guò)MyD88依賴和MyD88非依賴兩種途徑引起TLR4介導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌減少，短肽TF2,3,4,5,8,9,10,11,12,13對(duì)NF-κB信號(hào)通路活性均表現(xiàn)出明顯抑制作用，短肽TF0,1,5,7,8能夠明顯降低細(xì)胞存活率。通過(guò)本研究，發(fā)現(xiàn)TcpB主要通過(guò)分子結(jié)構(gòu)中的DDloop、αD、DE、βE發(fā)揮對(duì)TLR4通路干擾作用的，為進(jìn)一步闡明TcpB的作用機(jī)制提供了依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：TcpB 布魯氏菌 效應(yīng)子 TLR4
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R516.7
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文縮略詞表11-12
• 第1章 前言12-21
• 1.1 布魯氏菌病概述12-14
• 1.1.1 布魯氏菌病的危害12-13
• 1.1.2 布魯氏菌病的病原13
• 1.1.3 布魯氏菌的毒力因子13-14
• 1.2 布魯氏菌四型分泌系統(tǒng)14-20
• 1.2.1 四型分泌系統(tǒng)概述14
• 1.2.2 四型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)14-16
• 1.2.3 四型分泌系統(tǒng)的功能16-18
• 1.2.4 布魯氏菌 T4SS 的效應(yīng)蛋白18-20
• 1.3 論文研究目的和意義20-21
• 第2章 材料和方法21-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21-25
• 2.1.1 受試物21
• 2.1.2 細(xì)胞株21
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物21
• 2.1.4 主要儀器21-22
• 2.1.5 主要試劑及配方22-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-31
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)25
• 2.2.2 短肽的設(shè)計(jì)與合成25
• 2.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 法檢測(cè)細(xì)胞因子 mRNA 的表達(dá)25-28
• 2.2.4 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌水平28-30
• 2.2.5 蛋白質(zhì)印跡(westernblot)檢測(cè) NF-κB 信號(hào)通路改變30
• 2.2.6 乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測(cè)細(xì)胞毒性30-31
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法31-32
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-43
• 3.1 TcpB 短肽的設(shè)計(jì)與合成32-33
• 3.2 TcpB 短肽對(duì)細(xì)胞因子的影響33-40
• 3.2.1 TcpB 短肽對(duì)細(xì)胞因子 mRNA 表達(dá)水平的影響33-36
• 3.2.2 TcpB 短肽對(duì) RAW264.7 的細(xì)胞因子分泌水平的影響36-39
• 3.2.3 TcpB 短肽對(duì) C57BL/6J 的細(xì)胞因子分泌水平的影響39-40
• 3.3 TcpB 短肽對(duì) NF-κB 信號(hào)通路影響40-41
• 3.4 TcpB 短肽對(duì)細(xì)胞死亡率的影響41-43
• 第4章 討論43-48
• 4.1 TcpB 短肽對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)的影響44-46
• 4.2 TcpB 短肽對(duì) NF-κB 信號(hào)通路影響46
• 4.3 TcpB 短肽對(duì)細(xì)胞死亡率的影響46-48
• 第5章 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-56
• 作者簡(jiǎn)介56-57
• 致謝57

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  本文關(guān)鍵詞：布魯氏菌TIR結(jié)構(gòu)域蛋白TcpB影響TLR通路的分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：352513