本文關(guān)鍵詞：成人手足口病相關(guān)腸道病毒非中和抗體反應(yīng)的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腸道病毒(enterovirus,EV)是自然界中普遍存在的一類病毒,至今已發(fā)現(xiàn)200多個(gè)血清型和基因型,可引發(fā)多種疾病,包括常見的由EV71和CA16感染引起的手足口病(hand,foot,and mouth disease,HFMD)。目前中和抗體檢測(cè)是對(duì)腸道病毒血清學(xué)檢測(cè)的有效途徑,對(duì)于以交叉表位為核心的非中和抗體反應(yīng)的研究尤其是腸道病毒的ELISA檢測(cè)方面尚未形成有價(jià)值的研究成果。本研究首次應(yīng)用非中和抗體檢測(cè)的方法,探究到正常人群血清中腸道病毒A種(CA5、CA10、CA6、CA16、EV71),對(duì)照組腸道病毒B種(CB3)和C種(PV1)幾種病毒VP1的非中和抗體水平及其動(dòng)態(tài)變化,提高了對(duì)腸道病毒感染的普遍性的認(rèn)識(shí),對(duì)建立基于ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA的腸道病毒流行病學(xué)監(jiān)測(cè)方法有重要意義。(一)腸道病毒VP1序列的全基因合成及原核表達(dá)全基因合成了PV1和HAV衣殼蛋白VP1的DNA序列,構(gòu)建p ET-32a-PV1 VP1和p ET-32a-HAV VP1原核表達(dá)載體。另選取本實(shí)驗(yàn)室已制備好的p ET-32a-EV71 VP1,p ET-32a-CA16 VP1,p ET-32a-CA5 VP1,p ET-32a-CA6 VP1,p ET-32a-CB3 VP1原核表達(dá)載體,原核表達(dá)并用鎳柱親和層析的方法純化上述七種重組蛋白;經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定,獲得了純度較高的EV71,CA16,CA5,CA6,CB3,PV1和HAV VP1的重組蛋白。(二)上海獻(xiàn)血員腸道病毒VP1非中和抗體反應(yīng)的檢測(cè)和分析以本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的新型免疫球蛋白結(jié)合分子(Novel Evolved Immunoglobulin(Ig)-Binding Molecule,NEIBM)LD5作為二抗,應(yīng)用NEIBM-ELISA方法,分別檢測(cè)了腸道病毒A種的EV71,CA16,CA5,CA6,腸道病毒B種的CB3,腸道病毒C種的PV1及嗜肝病毒屬的HAV等七種腸道病毒VP1在2013年8月和2014年5月收集的上海市正常獻(xiàn)血員血清中的非中和抗體反應(yīng)水平,并對(duì)48份高反應(yīng)血清進(jìn)行了競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)。通過對(duì)抗體反應(yīng)水平、抗體反應(yīng)相關(guān)系數(shù)、競(jìng)爭(zhēng)抑制水平和競(jìng)爭(zhēng)抑制的相關(guān)系數(shù)等指標(biāo)的綜合分析發(fā)現(xiàn),上海正常人群血清中普遍存在腸道病毒的非中和反應(yīng)抗體;不同病毒的抗體反應(yīng)強(qiáng)度不同,抗CB3 VP1非中和抗體反應(yīng)最強(qiáng),抗PV1 VP1次之,抗腸道病毒A種VP1反應(yīng)較弱,抗HAV VP1抗體反應(yīng)最弱;不同病毒VP1非中和抗體反應(yīng)的相關(guān)系數(shù)與氨基酸序列的同源性水平成正比;EV71VP1與腸道病毒A種的其他成員的非中和抗體反應(yīng)特點(diǎn)不同;不同時(shí)間,腸道病毒的非中和抗體反應(yīng)出現(xiàn)明顯差異。(三)上海獻(xiàn)血員腸道病毒VP1非中和抗體反應(yīng)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)為深入探究腸道病毒的非中和抗體反應(yīng)能否用于腸道病毒流行情況的檢測(cè),本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)應(yīng)用NEIBM-ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA兩種方法,檢測(cè)腸道病毒A種的CA10,CA6,CA16,EV71,腸道病毒B種的CB3,腸道病毒C種的PV1六種腸道病毒VP1在2014年4月、2014年6月、2014年8月、2014年10月、2014年12月和2015年3月收集的上海市正常獻(xiàn)血員血清中的非中和抗體反應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化。對(duì)抗體反應(yīng)水平、抗體反應(yīng)相關(guān)系數(shù)、競(jìng)爭(zhēng)抑制水平和競(jìng)爭(zhēng)抑制的相關(guān)系數(shù)等指標(biāo)的分析發(fā)現(xiàn):不同時(shí)間,各病毒VP1的反應(yīng)性水平無(wú)明顯變化;不同時(shí)間,抗體反應(yīng)的相關(guān)系數(shù)相對(duì)平穩(wěn);不同時(shí)間,各病毒VP1競(jìng)爭(zhēng)抑制率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與上述指標(biāo)不同的是,競(jìng)爭(zhēng)抑制率相關(guān)系數(shù)有很明顯的變化:CA16 VP1與EV71 VP1競(jìng)爭(zhēng)抑制抗-CA16 VP1的相關(guān)系數(shù)隨時(shí)間變化明顯,2014年4月和6月,二者相關(guān)系數(shù)小于0.1,8月-12月二者相關(guān)系數(shù)均大于0.4,提示2014年4月,正常人群中可能有CA16的流行;2014年8月,CB3 VP1與除CB3以外的其他腸道病毒VP1競(jìng)爭(zhēng)抑制抗-CB3 VP1的相關(guān)系數(shù)出現(xiàn)了一致的明顯下降,提示2014年8月,正常人群中可能有CB3的流行;2014年6月,CA10 VP1與除CA10以外的其他腸道病毒VP1競(jìng)爭(zhēng)抑制抗-CA10VP1的相關(guān)系數(shù)出現(xiàn)了一致的明顯下降,提示2014年6月,正常人群中可能有CA10的流行;2014年10月,PV1 VP1與除PV1以外的其他腸道病毒VP1競(jìng)爭(zhēng)抑制抗-PV1VP1的相關(guān)系數(shù)出現(xiàn)了一致的明顯下降,提示2014年10月,正常人群中可能有PV1的流行。為驗(yàn)證上述對(duì)腸道病毒在正常人群中流行狀況的推測(cè),我們又進(jìn)行了正常獻(xiàn)血員血清抗腸道病毒VP1-Ig G、Ig M的非中和抗體檢測(cè)。分析抗體反應(yīng)水平和相關(guān)系數(shù)可知,2014年4月,抗-CA16 VP1 Ig G和Ig M抗體反應(yīng)水平與其他月份有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,2014年4月至8月,抗-CA16 VP1 Ig G和Ig M抗體反應(yīng)相關(guān)系數(shù)大于0.4,高于其他月份,支持2014年6月正常人群中有CA16的流行;2014年8月-12月,抗-CB3 Ig G和Ig M反應(yīng)性相關(guān)系數(shù)大于0.3,高于其他月份,支持2014年8月正常人群中有CB3的流行;2014年6月抗-CA10 VP1 Ig G和Ig M的反應(yīng)相關(guān)系數(shù)達(dá)到最高值,推測(cè)2014年6月正常人群中有與CA10相近病毒的流行;2014年10月抗-PV1 VP1 Ig G和Ig M的反應(yīng)相關(guān)系數(shù)達(dá)到最高值,推測(cè)2014年10月正常人群中有與PV1相近病毒的流行。上述研究說(shuō)明正常人群中腸道病毒非中和抗體檢測(cè)和分析可反映腸道病毒在正常人群中的流行狀況,進(jìn)一步改進(jìn)后有望成為評(píng)價(jià)、監(jiān)測(cè)腸道病毒流行狀況的新方法。
【關(guān)鍵詞】：腸道病毒 新型免疫球蛋白結(jié)合分子 血清學(xué)檢測(cè) 非中和抗體反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.5;R446.6
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 縮略詞表10-11
• 前言11-13
• 第一部分 多種腸道病毒VP1全基因合成及原核表達(dá)純化13-31
• 一、材料與方法14-26
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-29
• 三、討論29-31
• 第二部分 上海獻(xiàn)血員腸道病毒VP1非中和抗體反應(yīng)的檢測(cè)和分析31-43
• 一、材料與方法31-35
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-40
• 三、討論40-43
• 第三部分 上海獻(xiàn)血員腸道病毒VP1非中和抗體反應(yīng)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)43-60
• 一、材料與方法43-44
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-58
• 三、討論58-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 附錄64-76
• 綜述 手足口病相關(guān)腸道病毒的常用檢測(cè)技術(shù)76-82
• 參考文獻(xiàn)78-82
• 發(fā)表論文和參加科研工作情況說(shuō)明82-83
• 致謝83

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