結(jié)核病(tuberculosis)自古以來就是嚴(yán)重威脅人類生命安全的公共衛(wèi)生難題,其是由致病性的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)侵入機(jī)體導(dǎo)致的慢性呼吸道傳染性疾病,其已成為傳染性疾病中導(dǎo)致患者死亡的頭號死因,截止到目前全世界約有三分之一的人口既往或正遭受MTB的侵襲。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)的統(tǒng)計結(jié)果顯示,2015年全世界范圍內(nèi)新發(fā)的結(jié)核病患者數(shù)量高達(dá)1040萬例,結(jié)核病已導(dǎo)致逾140萬人死亡。隨著不規(guī)范治療導(dǎo)致耐藥結(jié)核菌株的肆虐、人口流動的加速以及艾滋病并發(fā)結(jié)核感染患者的增加,結(jié)核病疫情又呈現(xiàn)出加劇蔓延趨勢。早期、及時、準(zhǔn)確地檢測MTB是有效控制結(jié)核病、減少結(jié)核擴(kuò)散和耐藥菌株產(chǎn)生的有效手段。目前臨床上常用的MTB檢測方法包括結(jié)核診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”細(xì)菌培養(yǎng)、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等均具有不同程度的缺陷,比如耗時長、穩(wěn)定性差、假陽性率高、影響因素多、靈敏度和特異性差等。此外,由于我國廣泛開展卡介苗(Bacille Calmette-Guerin,BCG)接種,要避開BCG導(dǎo)致的假陽性結(jié)果準(zhǔn)確檢測MTB就更為困難。當(dāng)MTB感染宿主以后,患者體內(nèi)首先會出現(xiàn)MTB的特異性抗原,這些抗原不受患者免疫狀態(tài)的影響,因此檢測體液中的MTB抗原對于結(jié)核病的早期確診具有重要的臨床意義。6-kDa早期分泌抗原靶標(biāo)(6-kDa early secretory antigenic target,ESAT-6)是MTB分泌的一種早期分泌蛋白,其只在致病性的分枝桿菌中存在,而在BCG菌株中缺失,是理想的MTB檢測生物標(biāo)志物。適體具有合成簡便、成本低廉、性質(zhì)穩(wěn)定、易于修飾、適用性廣,能與目標(biāo)配體專一性結(jié)合等優(yōu)點,其與靶標(biāo)結(jié)合的親合力高于抗體。以特異性適體為識別元件構(gòu)建的電化學(xué)適體傳感器兼具適體的高特異性和電化學(xué)分析方法響應(yīng)快速、靈敏度高的特性。為了克服MTB檢測方法存在的缺陷,本研究擬以ESAT-6作為檢測靶標(biāo),以其特異性適體作為識別元件,利用聚(二烯丙基二甲基氯化銨)功能化還原氧化石墨烯摻雜金屬有機(jī)骨架(Poly(diallyldimethylammonium chloride)functioned reduced graphene oxide doped with metal-organic framework,P-MOF-rGO)納米復(fù)合物的大比表面積、高導(dǎo)電率和穩(wěn)定性構(gòu)建電化學(xué)適體傳感器用于MTB檢測,以實現(xiàn)結(jié)核病的早期、準(zhǔn)確診斷。本研究的主要內(nèi)容如下:目的:以P-MOF-rGO納米雜化物作為電極的固載材料構(gòu)建label-free型電化學(xué)適體傳感器用于結(jié)核抗原ESAT-6的超靈敏檢測,為結(jié)核病的早期、準(zhǔn)確診斷提供有效平臺。方法:制備P-MOF-rGO納米雜化材料固載到玻碳電極(Glassy carbon electrode,GCE)表面,以甲苯胺藍(lán)(Toluidine Blue,TB)作為電活性物質(zhì)孵育到電極上,利用鉑金核殼(platinum/gold core/shell,Pt@Au)優(yōu)異的電催化性能進(jìn)行電信號放大,通過金硫鍵將巰基化的ESAT-6連接適體(ESAT-6 binding aptamer,EBA)結(jié)合到GCE表面,用小牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)封閉多余的活性位點來構(gòu)建電化學(xué)適體傳感器,并對TB和Pt@Au的體積進(jìn)行優(yōu)化。通過檢測適體與不同濃度ESAT-6結(jié)合前后電流的變化來確定傳感器的靈敏度。以葡萄糖、BSA、抗壞血酸(ascorbic acid,AA)、培養(yǎng)濾液蛋白(10-kDa culture filtrate protein,CFP-10)等內(nèi)源性分子作為干擾物質(zhì)考察傳感器的特異性。通過采用循環(huán)伏安法(Cyclic voltammetry,CV)連續(xù)掃描50次電極來考察傳感器的穩(wěn)定性。檢測5支相同濃度ESAT-6(1 ng/mL)孵育后的電極來考察傳感器的重現(xiàn)性。對血清樣本進(jìn)行檢測,以考察傳感器的臨床適用性。結(jié)果:所構(gòu)建的適體傳感器在TB體積為5μL,Pt@Au體積為8μL時具有最佳的檢測行為。在1.0×10~-44 ng/mL~2.0×10~2 ng/mL的范圍內(nèi),ESAT-6濃度與傳感器峰值電流呈線性關(guān)系,傳感器的檢測限(limit of detection,LOD)為3.3×10~-55 ng/mL。干擾實驗結(jié)果表明,該傳感器能夠特異性識別ESAT-6,對干擾物質(zhì)響應(yīng)差。穩(wěn)定性試驗提示穩(wěn)定性良好,50次連續(xù)掃描后,電流響應(yīng)僅下降約3.5%。重現(xiàn)性試驗提示該傳感器重現(xiàn)性較好,5支電極檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為2.9%。適體傳感器檢測血清樣本中ESAT-6的加標(biāo)回收率為99%~102%,該結(jié)果令人滿意。結(jié)論:所構(gòu)建的超靈敏檢測ESAT-6的電化學(xué)適配體傳感器制備簡便、線性檢測范圍寬、LOD低、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好,在實際血清樣品中測定ESAT-6具有良好的特異性和滿意的的加標(biāo)回收率,有望為MTB感染的及時準(zhǔn)確診斷提供有效的技術(shù)平臺。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R52;TP212.2;O657.1
【部分圖文】：

表明 P-MOF-rGO 納米復(fù)合材料已經(jīng)成功制備。Pt@Au 納米顆粒顯示出帶有毛刺的球形結(jié)構(gòu)并呈均勻分散（圖 1D）。圖.1 (A) MOF, (B) rGO 納米片, (C) P-MOF-rGO 納米復(fù)合物的 FESEM 圖和(D) Pt@Au 納米顆粒的 TEM 圖

的特征吸收峰與文獻(xiàn)報道的一致，表明它 a）顯示在 1560 和 1365 cm-1處有兩個特C-O 鍵的不對稱以及對稱伸縮振動。3460表明 MOF 沒有完全干燥。745cm-1處的特動。Fe-O 的特征吸收峰可在 555 cm-1處觀察的寬吸收峰（曲線 b），這歸因于 H2O 分的強(qiáng)吸收峰對應(yīng)的是 C = C。1570 cm-1附如曲線 c 所示，在 1690，1530，1410 和化納米材料的特征吸收峰。位于 1690 cm-1 1410 cm-1處的強(qiáng)吸收峰分別由羧基的不基對苯二甲酸連接體中苯環(huán)的 C-H 鍵的彎據(jù)一致，表明該復(fù)合納米材料可以用作適

圖. 3 P-MOF-rGO 納米復(fù)合物的 XPS 分析圖Fig. 3 XPS analysis of P-MOF-rGO nanohybrid感器的電化學(xué)表征過程
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本文編號：2890783