背景我們以前的研究表明,Ⅱ型弓形蟲的致密顆粒蛋白15(dense granule protein15_Ⅱ,GRA15_Ⅱ)可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1極化;構(gòu)建的gra15_Ⅱ慢病毒(lentivirus-gra15_Ⅱ,LV-gra15_Ⅱ)能轉(zhuǎn)化巨噬細(xì)胞為M1(LV-gra15_Ⅱ-M1)而使后者發(fā)揮有效的預(yù)防日本血吸蟲病肝纖維化的作用。其中,LV-gra15_Ⅱ-M1分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)在溶解膠原纖維中起到重要的作用。本研究中,我們構(gòu)建mmp13慢病毒,并體外轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞。將該巨噬細(xì)胞(LV-mmp13-M)輸注入日本血吸蟲病小鼠體內(nèi),了解其對(duì)日本血吸蟲病肝纖維化的治療作用和機(jī)制。方法首先構(gòu)建LV-mmp13和LV-gra15_Ⅱ,然后將其轉(zhuǎn)入巨噬細(xì)胞株RAW264.7中,并篩選出穩(wěn)定的LV-gra15_Ⅱ-M、LV-mmp13-M。用流式測定Ly6C以了解Ly6C表達(dá)情況。血吸蟲尾蚴感染雌性Balb/c小鼠6周后,將小鼠隨機(jī)分為四組:PBS、LV-blank-M、LV-gra15_Ⅱ-M和LV-mmp13-M組,并分別通過尾靜脈高壓注射相應(yīng)的細(xì)胞和PBS。在感染后第8周無痛麻醉處死所有小鼠。取血清檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-pyruvictransaminase,ALT)、用ELISA檢測HA含量,取肝臟組織分別做羥脯胺酸(HYP)含量檢測、HE和Masson染色,并用qRT-PCR、Western-blotting及免疫組化測定MMP13、iNOS、Arg-1、CCL2、α-SMA、ColⅠ。在體外實(shí)驗(yàn)中,分別將RAW264.7、LV-blank-M、LV-gra15_Ⅱ-M和LV-mmp13-M與小鼠成纖維細(xì)胞株JS1共培養(yǎng),ELISA方法檢測培養(yǎng)液中ColⅠ、MMP13和CCL2含量,流式檢測JS1凋亡。結(jié)果成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)的LV-mmp13-M和LV-gra15_Ⅱ-M,其中,LV-gra15_Ⅱ-M具有M1表型。LV-mmp13-M表現(xiàn)為Ly6C低表達(dá)而LV-gra15_Ⅱ-M為高表達(dá)。在LV-mmp13-M組中,血HA、肝HYP、ColⅠ、肝蟲卵肉芽腫和纖維化程度均明顯改善,說明LV-mmp13-M能有效逆轉(zhuǎn)肝纖維化。進(jìn)一步的研究表明,LV-mmp13-M順利進(jìn)入肝組織中,并分泌大量的MMP13蛋白,后者促進(jìn)了膠原蛋白溶解。此外,LV-mmp13-M分泌的CCL2及其他細(xì)胞因子在誘導(dǎo)肝成纖維細(xì)胞的凋亡,抑制肝纖維化方面也起到了一定的作用。本研究也表明,LV-gra15_Ⅱ-M沒有明顯的治療肝纖維化的作用。結(jié)論LV-mmp-13-M通過分泌MMP13、CCL2及其他細(xì)胞因子溶解膠原纖維并促使肝成纖維細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮逆轉(zhuǎn)日本血吸蟲病肝纖維化的作用。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R532.21;R575.2
【部分圖文】：

圖 1：LV-mmp13-M 與 JS1 共培養(yǎng)結(jié)果首先我們依據(jù)小鼠的基因庫合成 mmp13，再根據(jù)弓形蟲的基因庫構(gòu)建 gra15Ⅱ，然后分別將這兩段基因用慢病毒包裝成 LV-mmp13 和 LV-gra15Ⅱ，再分別將它們轉(zhuǎn)染到巨噬細(xì)胞株 RAW264.7，并經(jīng)體外培養(yǎng)、抗性篩選和熒光顯微鏡檢測獲得穩(wěn)定、高轉(zhuǎn)染率的 LV-gra15Ⅱ-M 和 LV-mmp13-M 細(xì)胞系。在小鼠感染尾蚴第六周時(shí)通過尾靜脈高壓注射上述相應(yīng)的細(xì)胞，在感染后第 8 周無痛處死所有小鼠。取血清用ELISA 檢測透明質(zhì)酸（HA）含量，取肝臟組織分別做羥脯胺酸（HYP）含量檢測、H＆E 和 Masson 染色，并用 qRT-PCR、及免疫組化測定 MMP13、iNOS、Arg-1、CCL2、α-SMA、ColⅠ。在體外實(shí)驗(yàn)中，如圖 1：分別將 RAW264.7、LV-blank-M、LV-gra15Ⅱ-M 和 LV-mmp13-M 與小鼠成纖維細(xì)胞株 JS1 共培養(yǎng)，ELISA 方法檢測培養(yǎng)液中 ColⅠ、MMP13 和 CCL2 含量,流式檢測 JS1 凋亡。

圖 11：LV-mmp13-M 治療肝纖維化機(jī)制圖本研究表明，如圖 2：LV-mmp13-M 通過分泌 MMP13、CCL2 及其他細(xì)胞因溶解膠原纖維并促使肝成纖維細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮逆轉(zhuǎn)日本血吸蟲病肝纖維化的作用。2 材料與方法2.1 試劑和儀器2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)所需要的試劑：高糖及低糖的 DMEM 培養(yǎng)基，胎牛血清 F從蒙特利爾的 Wisent 合肥分公司（Canada）和中國康明分別購入雙抗溶液（青霉素、鏈霉素）、無血清細(xì)胞防凍液以及胰酶消化液從碧云天公司（江蘇，中國）購入。Transwell 培養(yǎng)板購于合肥鴻

生物公司合成的mmp13基因和被克隆的基因序列比較
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本文編號(hào)：2890742