發(fā)布時(shí)間：2020-11-09 05:21

　　 目的:探討吉西他濱對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中乙肝病毒前基因組RNA(pregenomic RNA,pgRNA)轉(zhuǎn)錄以及乙肝病毒復(fù)制的影響及其可能的作用機(jī)制。方法:使用不同濃度吉西他濱處理HepG2.2.15細(xì)胞,分別使用CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)法檢測(cè)細(xì)胞活性、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒pgRNA、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)、乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)、乙肝病毒DNA(hepatitis B virus DNA,HBV DNA);實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)吉西他濱作用下HepG2.2.15細(xì)胞中與pgRNA轉(zhuǎn)錄有關(guān)的調(diào)控基因肝細(xì)胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor4,HNF4α)、P38蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase,P38MAPK)、環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(CAMP responsive element binding protein 1,CREB1)、核轉(zhuǎn)錄因子p65(nuclear factor-kappa B p65,NF-κb p65)、組蛋白去乙�；�1(histone deacetylase 1,HDAC1)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha,PGC-1α)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子O1(forkhead box protein O1,FOXO1)、相關(guān)調(diào)控基因沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(sirtuin 1,SIRT1)、P53 mRNA水平以及pgRNA的表達(dá)量,分析這些基因隨吉西他濱濃度變化與pgRNA隨濃度變化的相關(guān)性,找出與pgRNA變化相關(guān)性最高的基因,并使用Western blot在蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證吉西他濱對(duì)此基因蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響。結(jié)果:吉西他濱對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的生長(zhǎng)顯示出濃度以及劑量依賴性的抑制作用;吉西他濱使細(xì)胞凋亡率增高;吉西他濱使細(xì)胞更多的細(xì)胞停滯在G_0G_1期,而處于S期細(xì)胞比例降低;吉西他濱明顯增加HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒pgRNA,72 h之內(nèi)呈現(xiàn)明顯的時(shí)間與劑量依賴性;吉西他濱作用細(xì)胞24 h會(huì)使細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的HBeAg增加;吉西他濱促進(jìn)HNF4αmRNA、HNF4α蛋白質(zhì)表達(dá)量增加,且在所檢測(cè)的與乙肝病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)有關(guān)的基因中,HNF4αmRNA變化趨勢(shì)與HBV pgRNA變化趨勢(shì)相關(guān)性最高。結(jié)論:吉西他濱可在細(xì)胞水平促進(jìn)乙肝病毒pgRNA轉(zhuǎn)錄以及乙肝病毒的復(fù)制,其機(jī)制為通過(guò)促進(jìn)乙肝病毒轉(zhuǎn)錄因子HNF4α的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
【部分圖文】：

24、48、72 h時(shí)吉西他濱明顯增加HepG2.2.15細(xì)胞中的乙肝病毒pgRNA（與各自的對(duì)照組相比，24 h時(shí)2、20、50μmol/L吉西他濱組的P值分別為0.005、0.001、0.006;48 h時(shí)P值分別為0.004、0.000、0.024;72 h時(shí)P值分別為0.003、0.003、0.001），吉西他濱導(dǎo)致的乙肝病毒pgRNA的增加呈明顯的時(shí)間以及劑量依賴性。當(dāng)藥物作用于HepG2.2.15細(xì)胞96 h，乙肝病毒pgRNA增加的幅度不再明顯（P值分別為0.026、0.117、0.092），增加幅度在96 h時(shí)無(wú)時(shí)間依賴性（表5、圖1）。2.6 吉西他濱對(duì)乙肝病毒pgRNA相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子m RNA的影響以及各基因m RNA變化與pg RNA變化的相關(guān)性分析

不同濃度的吉西他濱作用于HepG2.2.15細(xì)胞48 h，檢測(cè)乙肝病毒pgRNA以及各pgRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因mRNA的表達(dá)量，使用相鄰兩濃度乙肝病毒pgRNA表達(dá)量的差值、各相關(guān)調(diào)控基因mRNA表達(dá)量的差值進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示（圖2、圖3、圖4），在所有3個(gè)途徑的9個(gè)與pgRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的基因中，隨著吉西他濱濃度的變化，HNF4αmRNA的變化趨勢(shì)與pgRNA的變化趨勢(shì)相關(guān)性最高（r=0.934,P=0.020），其余基因mRNA變化趨勢(shì)與pgRNA變化趨勢(shì)相關(guān)性不顯著（均P>0.05）。2.7 吉西他濱對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中HNF4α蛋白表達(dá)量的影響

除最大濃度的100μmol/L外，與對(duì)照組相比，所有濃度的吉西他濱均會(huì)導(dǎo)致HepG2.2.15細(xì)胞中HNF4α蛋白的表達(dá)量增加（表7、圖5）。圖4 途徑三（去乙�；窰DAC1、SIRT1途徑）mRNA變化趨勢(shì)與pgRNA變化趨勢(shì)的相關(guān)性
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