發(fā)布時(shí)間：2020-11-06 14:58

　　 念珠菌是侵襲性真菌感染的最常見(jiàn)致病菌,單核-巨噬細(xì)胞是參與機(jī)體固有免疫反應(yīng)的重要細(xì)胞。本文探討了巨噬細(xì)胞在機(jī)體針對(duì)念珠菌的免疫反應(yīng)中所發(fā)揮的作用,主要分兩大部分。首先,通過(guò)建立小鼠腹腔白念珠菌感染模型,發(fā)現(xiàn)與其他免疫細(xì)胞相比,巨噬細(xì)胞吞噬白念珠菌的比例最高,說(shuō)明在白念珠菌感染后巨噬細(xì)胞是持續(xù)存在的、最主要的吞噬細(xì)胞。通過(guò)為小鼠靜脈注射氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(Clodronate liposomes),建立清除巨噬細(xì)胞的小鼠模型,發(fā)現(xiàn)清除巨噬細(xì)胞的小鼠白念珠菌系統(tǒng)感染后體重明顯減輕,死亡率明顯增加,提示了巨噬細(xì)胞在抗念珠菌感染中的核心地位。樹(shù)突細(xì)胞相關(guān)C型凝集素1(Dectin-1)是一種能夠特異性識(shí)別白念珠菌胞壁成分β-葡聚糖的模式識(shí)別受體;通過(guò)轉(zhuǎn)染特異性siRNA的方法干擾Dectin-1受體的表達(dá),給予熒光標(biāo)記的白念珠菌孢子誘導(dǎo)THP-1巨噬樣細(xì)胞,以熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀兩種方法檢測(cè)對(duì)白念珠菌的吞噬情況,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA-Dectin-1后細(xì)胞對(duì)白念珠菌的吞噬水平明顯降低,說(shuō)明Dectin-1受體在巨噬細(xì)胞對(duì)白念珠菌的吞噬效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。近些年來(lái)由非白念珠菌感染致病的情況逐漸增多,特別是近平滑念珠菌、熱帶念珠菌臨床致病較高;因此,本研究關(guān)注了近平滑念珠菌、熱帶念珠菌所誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。THP-1巨噬樣細(xì)胞給予近平滑念珠菌、熱帶念珠菌體外誘導(dǎo),通過(guò)q-PCR、ELISA兩種方法檢測(cè),發(fā)現(xiàn)其均可誘導(dǎo)促炎癥因子(TNF-α、IL-6)表達(dá)及分泌水平的增加,并呈現(xiàn)劑量、時(shí)間依賴效應(yīng);通過(guò)western blotting、共聚焦顯微鏡證明p38MAPK、ERK1/2MAPK、NF-κB等信號(hào)分子被激活,且流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Dectin-1受體表達(dá)上調(diào),證明其參與炎癥反應(yīng)。本研究的第二部分關(guān)注了白念珠菌對(duì)巨噬細(xì)胞自噬的影響。以THP-1巨噬樣細(xì)胞、RAW 264.7細(xì)胞為研究對(duì)象,通過(guò)白念珠菌刺激聯(lián)合多種溶酶體抑制劑,包括E-64d+pepstatin、氯喹(CQ)、氯化銨(NH4Cl)及巴弗洛霉素-A1(BAF-A1),western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)白念珠菌可以降低LC3-I型向LC3-II型的轉(zhuǎn)換,丫啶橙(AO)染色熒光觀察發(fā)現(xiàn)白念珠菌的吞噬使巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體的形成減少,說(shuō)明白念珠菌感染降低巨噬細(xì)胞的基礎(chǔ)自噬流水平。同時(shí),通過(guò)轉(zhuǎn)染GFP-LC3、RFP-GFP-LC3桿狀病毒來(lái)熒光標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)LC3的分布,發(fā)現(xiàn)LC3可被募集到白念珠菌孢子周?chē)?參與對(duì)白念珠菌的吞噬過(guò)程。通過(guò)分析白念珠菌、LC3、吞噬關(guān)鍵分子Rubicon、溶酶體的共定位關(guān)系,驗(yàn)證了 LC3相關(guān)吞噬(LAP)的存在;且白念珠菌的處理會(huì)導(dǎo)致LC3的募集,而不伴自噬流的關(guān)鍵分子p62、ATG9A的共定位,證明了白念珠菌被巨噬細(xì)胞吞噬的過(guò)程主要發(fā)生LAP,而非形成自噬小體。為探索白念珠菌抑制巨噬細(xì)胞基礎(chǔ)自噬流的分子機(jī)制,本研究通過(guò)白念珠菌聯(lián)合雷帕霉素、Torin 1、pp242等MTOR抑制劑體外誘導(dǎo)THP-1巨噬樣細(xì)胞,western blotting檢測(cè)MTOR通路磷酸化水平的變化,發(fā)現(xiàn)白念珠菌通過(guò)非MTOR依賴途徑減低巨噬細(xì)胞的自噬流水平;然而,白念珠菌重要的胞壁成分β-glucan的誘導(dǎo)可增加THP-1巨噬樣細(xì)胞的基礎(chǔ)自噬流。我們推斷,吞噬白念珠菌后基礎(chǔ)自噬流減低的效應(yīng)可能與LAP發(fā)生時(shí)對(duì)LC3的占用相關(guān)。我們還探討了白念珠菌減低自噬流的效應(yīng)對(duì)巨噬細(xì)胞DNA合成、增殖、凋亡、活性氧產(chǎn)生的影響,并發(fā)現(xiàn)白念珠菌誘導(dǎo)除抑制自噬流外,還會(huì)導(dǎo)致明顯的DNA合成的抑制,但對(duì)細(xì)胞凋亡、增殖水平無(wú)明顯影響。白念珠菌誘導(dǎo)可導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生增加;然而,通過(guò)藥物增加自噬水平后并不影響白念珠菌對(duì)活性氧誘導(dǎo)的水平。自噬在巨噬細(xì)胞抗念珠菌免疫反應(yīng)中的作用仍有待繼續(xù)研究。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R756
【部分圖文】：

３）?ＰＢＳ?ｌｉｐｏｓｏｍｅ＋ＳＣ５３１４?組：ｄ－１、ｄｌ?靜脈注射?ＰＢＳ?ｌｉｐｏｓｏｍｅ?２０（＾Ｌ／ｍｏｕｓｅ；?ｄＯ?靜??脈注射?ＳＣ５３１４?ｌｘｌ〇６ＣＦＵ／ｍｏｕｓｅ〇??４）?Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ?ｌｉｐｏｓｏｍｅ＋ＳＣ５３１４?組：ｄ－１、ｄｌ?靜脈注射?Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ?ｌｉｐｏｓｏｍｅ??２００（ａＬ／ｍｏｕｓｅ；?ｄＯ?靜脈注射?ＳＣ５３１４?ｌｘｌ〇６ＣＦＵ／ｍｏｕｓｅ。??２．觀察小鼠狀態(tài)，每日固定時(shí)間稱重，記錄小鼠存活情況，小鼠存活率＝（小鼠總??數(shù)一死亡小鼠數(shù)）／小鼠總數(shù)ｘｌＯＯ％。??結(jié)果??一．小鼠白念珠菌腹腔感染模型中不同免疫細(xì)胞的吞噬作用比較??小鼠腹腔注射熒光標(biāo)記的白念珠菌（熒光標(biāo)記不影響白念珠菌活力）不同時(shí)間??點(diǎn)后，分析腹腔細(xì)胞內(nèi)吞噬白念珠菌的各種細(xì)胞成分比例的變化。發(fā)現(xiàn)隨著感染時(shí)??間的延長(zhǎng)，巨噬細(xì)胞吞噬白念珠菌的比例逐漸增高，在４小時(shí)后持續(xù)為數(shù)量最高的??細(xì)胞（圖１），說(shuō)明了在白念珠菌局部感染后，巨噬細(xì)胞是持續(xù)存在的、最主要的免??疫細(xì)胞。??＾１〇°＂???Ｍａｃｒｏｈａｅ??

?０．００１）。而中性粒細(xì)胞的比例在不同小鼠組間無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)??圖３。??＿?＿?＊＊＊??６〇－｜?Ｉ?１??ＩＳ?＿??２?３〇－?■?Ｉ??Ｓ?２０＿圍與ｓ??＾?１０?丄??〇?Ｉ剩?Ｉ＝ｉ?Ｉ?＿＿?＊?＿＿??ｈ?＾?ＥＳ３?＝?麵?隱?ＰＢＳ??ｉ?２：?＿?＿?■丨?＊＊?Ｉ?圓翏?Ｅ３３?ＰＢＳ－ｌｉｐｏｓｏｍｅ??ｑＩ?ｉｌ＾?ｔｓｓａ?ｐｍ?—?ＥｘＳａ?ＥＳ３?國(guó)?Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ－ｌｉｐｏｓｏｍｅ??＼ｂｄｏｍｉｎａｌ?ｃａｖｉｔｙ?Ｌｙｍｐｈ?ｎｏｄｅ?Ｓｐｌｅｅｎ??圖２小鼠注射ｌｉｐｏｓｏｍｅ后不同器官的巨噬細(xì)胞比例變化（＊＊戶＜０．０１；?＊＊＊Ｐ＜０．００１）??ＮＳ??８－１?Ｉ?１??一?工??｜?６－?兩??�。矗�?議圖＿?＿?Ｑ??＝２＿?＿?ＮＳ?圖?Ｅ：ｓ３?■?園?ＰＢＳ??ｚ?幽肉圉?＇?１?纏陶國(guó)?ｍ?ＰＢＳ－ｌｉｐｏｓｏｍｅ??圉應(yīng)圍＠圍?ｓ?Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ－ｌｉｐｏｓｏｍｅ??Ａｂｄｏｍｉｎａｌ?ｃａｖｉｔｙ?Ｌｙｍｐｈ?ｎｏｄｅ?Ｓｐｌｅｅｎ??圖３小鼠注射ｌｉｐｏｓｏｍｅ后不同器官的中性粒細(xì)胞比例變化（ＮＳ：無(wú)差異）??三．小鼠系統(tǒng)感染白念珠菌菌株Ｃ１Ｍ、ＳＣ５３１４后體重變化情況??小鼠分組后分別靜脈注射白念珠菌菌株Ｃ１Ｍ、ＳＣ５３１４孢子ｌｘｌ〇６ＣＦＵ／ｍｏｕｓｅ，??檢測(cè)每組小鼠的體重變化，體重曲線見(jiàn)圖４�？梢�(jiàn)白念珠菌菌株ＳＣ５３１４的毒力程??度明顯強(qiáng)于Ｃ１Ｍ。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將使用這兩種毒力不同的白念珠菌菌株來(lái)確定小鼠清除??巨噬

三．小鼠系統(tǒng)感染白念珠菌菌株Ｃ１Ｍ、ＳＣ５３１４后體重變化情況??小鼠分組后分別靜脈注射白念珠菌菌株Ｃ１Ｍ、ＳＣ５３１４孢子ｌｘｌ〇６ＣＦＵ／ｍｏｕｓｅ，??檢測(cè)每組小鼠的體重變化，體重曲線見(jiàn)圖４�？梢�(jiàn)白念珠菌菌株ＳＣ５３１４的毒力程??度明顯強(qiáng)于Ｃ１Ｍ。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將使用這兩種毒力不同的白念珠菌菌株來(lái)確定小鼠清除??巨噬
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本文編號(hào)：2873290