鼠疫是一種傳播快、發(fā)病急、傳染性極強且病死率極高的自然疫源性烈性傳染病。鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis，以下簡稱鼠疫菌）是其病原體。據(jù)記載，在人類歷史上，世界范圍內曾爆發(fā)過3次鼠疫大流行，并致使至少一億六千萬人死亡�，F(xiàn)如今，鼠疫在全球重新進入了一個活躍期，同時其自然疫源地也在逐步擴增，人間鼠疫不斷發(fā)生。而在2000年，世界衛(wèi)生組織將鼠疫列為重新抬頭的傳染病。鼠疫菌本由o:1b血清型假結核耶爾森菌進化而來的。其廣泛存在于我們的生活環(huán)境中，并可經過水或食物進行傳播從而引發(fā)非致死性的腸道疾病。而在自然界中，嚙齒類和蚤類作為傳播媒介傳播鼠疫菌，使宿主可引發(fā)全身系統(tǒng)性感染的致死性疾病。另外，抗生素治療鼠疫雖然效果良好，但敗血癥型鼠疫與肺型鼠疫進展十分迅速，即使早期足量合理使用抗生素，病死率依然較高，且治療鼠疫的抗生素副作用較大。而近年來世界各地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)耐藥鼠疫菌菌株。因此，研究鼠疫疫苗具有重要意義。 傳統(tǒng)鼠疫疫苗中滅活全菌疫苗保護時間短，而且僅對腺鼠疫有效，已被淘汰；減毒活疫苗對腺鼠疫和肺鼠疫均具有良好的保護活性，但副作用嚴重，目前已在許多西方國家停止使用。重組亞單位疫苗能夠克服傳統(tǒng)疫苗的許多缺陷，不含有感染性組分，無致病性，而且具有在體內不復制的優(yōu)點，動物實驗表明其對腺鼠疫和肺鼠疫均具有良好的免疫保護作用，因此亞單位疫苗成為當前鼠疫疫苗研究的熱點。 目前鼠疫亞單位疫苗的研究大多是基于F1莢膜抗原和V抗原。為了研制一種安全、高效的鼠疫亞單位疫苗，我們從鼠疫菌疫苗株中提取純化了高純度天然F1抗原，同時避開V抗原產生免疫抑制作用的區(qū)段，克隆表達了不帶任何標簽和載體序列的部分V抗原(rV270抗原)。將rV270抗原和天然F1抗原分別吸附到人可用的鋁佐劑中制備了鼠疫亞單位疫苗，并經小鼠、豚鼠、兔和獼猴動物實驗證明具有良好的免疫保護作用和安全性。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，亞單位疫苗和EV76減毒活疫苗免疫的小鼠雖然維持較高的F1抗體滴度長達518天，但分別在免疫后56天、136天和518天三個不同時間點攻毒時均未發(fā)現(xiàn)F1抗體滴度有明顯升高的現(xiàn)象，這個結果顯然不符合記憶B細胞遇到相同抗原時快速、大量產生抗體的一般結論。眾所周知，維持長久體液免疫反應有兩種方式：第一，長壽命漿細胞通過不斷產生抗體維持機體的體液免疫反應；第二，記憶B細胞不斷分化出短壽命漿細胞，然后通過短壽命漿細胞分泌抗體維持體液免疫反應。因而通過鼠疫疫苗免疫小鼠后了解是否有記憶B細胞產生、記憶B細胞產生的動態(tài)變化以及記憶B細胞分化發(fā)育的分子機制，進而為新型鼠疫疫苗的設計和應用奠定基礎。 我們通過采用皮下注射人免疫劑量1/10的EV76減毒活疫苗和20μg/只劑量的F1亞單位疫苗免疫6-7周齡雌性Balb/c小鼠，分別在免疫后的八個不同時間點獲取小鼠脾臟細胞及骨髓細胞，用特異性抗體—CD19，CD27，CD38，IgD進行細胞表面抗體標記。通過流式細胞儀的篩選，分析記憶B細胞及漿細胞的含量變化。同時，建立四個實驗組和一個空白組，分別為EV76（1/5）組、EV76（1/10×2）組、EV76（1/10）+F1亞單位疫苗組、F1亞單位疫苗+EV76（1/10）組及空白組，通過多次免疫后，采用酶聯(lián)免疫法檢測小鼠抗體滴度的變化。而后進一步通過流式細胞分離技術分離小鼠的B淋巴細胞，即幼稚B細胞，記憶B細胞及漿細胞三種細胞，采用Trizol法提取這三種細胞的總RNA。最終采用RNA-seq技術測定小鼠的幼稚B細胞、記憶B細胞和漿細胞的總RNA表達譜，進而進行表達譜的比較。 通過本實驗證明EV76減毒活疫苗及F1亞單位疫苗免疫小鼠后，無論在脾臟細胞及骨髓細胞均有記憶B細胞的產生，并存在先上升后下降的變化趨勢，在免疫后7天，記憶B細胞及漿細胞開始產生，脾臟細胞及骨髓細胞中的記憶B細胞含量分別在免疫第42天和第56天時達到高峰，漿細胞含量在免疫第56天時達到高峰，而免疫第77時，記憶B細胞的總含量逐漸下降，直至免疫第98天記憶B細胞的含量已接近正常小鼠，漿細胞則在免疫第77天有所下降并維持一定水平。結果經過統(tǒng)計學分析，都具有顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義。酶聯(lián)免疫法檢測抗體滴度與記憶B細胞數(shù)量變化趨勢大體一致，均在在第56天達到高峰，而后維持穩(wěn)定的抗體滴度在一定水平上，且初次免疫EV76減毒活疫苗，而加強免疫F1亞單位疫苗的實驗組其抗體滴度明顯高于兩次免疫EV76減毒活疫苗組的抗體滴度�？俁NA測序將記憶B細胞與幼稚B細胞，漿細胞與幼稚B細胞，記憶B細胞與漿細胞進行比較。記憶B細胞與幼稚B細胞組共比對15765個基因，其中高表達基因697個，低表達基因820個，與細胞或免疫相關的基因共有131個；漿細胞與幼稚B細胞共比對16304個基因，其中高表達基因1574個，低表達基因451個，其中與細胞或免疫相關的基因有162個，記憶B細胞與漿細胞共比對16212個基因，其中高表達基因1495個，低表達基因252個，其中與細胞或免疫相關的基因有164個。 依據(jù)研究結果表明，①在免疫早期記憶B細胞在脾臟細胞及骨髓細胞中均無產生，脾臟細胞中的記憶B細胞逐漸增多直至免疫第42天達到高峰，而骨髓中的記憶B細胞則在免疫第56天達到峰值，隨后，脾臟細胞及骨髓細胞中的記憶B細胞的含量急劇下降，表明鼠疫疫苗免疫小鼠雖有產生但維持時間較短；另一方面，漿細胞在脾臟細胞中數(shù)量變化趨勢雖與骨髓細胞中的數(shù)量變化趨勢基本一致，但在總體數(shù)量上比較，漿細胞在脾臟細胞中的含量要遠遠高于骨髓細胞中的含量，這就說明漿細胞主要存在于脾臟細胞中。綜上所述，我們推測小鼠在免疫后可以長期維持較高的抗體滴度是由于長壽命漿細胞的作用。②依據(jù)酶聯(lián)免疫試驗結果，我們可以得出，小鼠首次接受較少量抗原免疫后，當再次接觸較大劑量的抗原免疫時，會產生明顯升高的抗體滴度的變化。因此可得知，抗體滴度的變化不僅與記憶B細胞的產生有關，而且同時很有可能與小鼠體內的抗原—抗體數(shù)量比例也有著密切聯(lián)系。③通過RNA-Seq技術對B淋巴細胞的三種亞群即幼稚B細胞、記憶B細胞和漿細胞的全基因組測序比對基因可以得出，與補體受體、免疫球蛋白家族、淋巴細胞抗原和細胞因子類等相關的基因在幼稚B細胞、記憶B細胞及漿細胞中均有發(fā)現(xiàn)，但這些基因在這三種細胞亞群中存在明顯差異。
【學位單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R516.8
【文章目錄】：
縮略詞表
摘要
Abstract
前言
    1. 鼠疫菌的概況與發(fā)展
    2. 淋巴細胞的分化與發(fā)育
    3. 鼠疫菌抑制宿主免疫系統(tǒng)
    4. 宿主對鼠疫菌的防御作用
    5. 宿主免疫反應的基本過程
    6. 鼠疫疫苗的研究
    7. 本實驗的目的和意義
    8. 實驗流程
1. 實驗材料
    1.1 實驗主要材料
    1.2 實驗所用主要試劑
2. 實驗方法
    2.1 動物實驗
    2.2 脾臟細胞提取及標記
    2.3 骨髓細胞提取及標記
    2.4 細胞流式分析
    2.5 脾臟細胞分選
    2.6 RNA-Seq 技術的表達譜檢測
    2.7 酶聯(lián)檢測法測定小鼠體內抗體
3.結果
    3.1 流式細胞分析
    3.2 流式細胞分選
    3.3 總 RNA 檢測
    3.4 總 RNA 表達譜檢測
    3.5 酶聯(lián)免疫法檢測免疫小鼠抗體的結果
4.討論
綜述
參考文獻
附錄
代表性論文
碩士期間完成的其他工作
碩士期間發(fā)表的論文
個人簡歷
致謝

【共引文獻】

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本文編號：2867301