背景及目的:肝癌是全球第六大常見惡性腫瘤,也是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大原因。由于肝癌早期缺乏特異性的臨床癥狀,且缺乏簡便易行的篩查方法,許多肝癌患者在診斷時已進入晚期階段。而相比于早期肝癌,晚期肝癌可獲得的治療方式有限,預(yù)后不良。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是中國人群肝癌發(fā)生的首要原因。為此,在慢性乙型肝炎或肝硬化人群中,定期、及早的篩查肝癌顯得尤為必要。尿液相比較于血液具有無創(chuàng)、簡便、易于操作的特點,是較為理想的生物標(biāo)志物檢測途徑,此項研究旨在發(fā)掘HBV相關(guān)肝癌患者尿液中的新型診斷或篩查生物標(biāo)志物,并評估其診斷肝癌的效能。目前臨床上,運用最為廣泛且最為認可的肝癌診斷標(biāo)志物為甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP),然而AFP在HBV感染的肝癌細胞中的生物學(xué)功能尚不清楚,本研究將擬通過進一步的實驗加以明確。方法:我們設(shè)計了發(fā)現(xiàn)隊列(n=40)以及驗證隊列(n=140),收集尿液標(biāo)本進行生物標(biāo)志物的研究。其中發(fā)現(xiàn)隊列包括四個組別:肝細胞癌組(肝癌組,10人),乙肝肝硬化組(肝硬化組,10人),慢性乙型病毒性肝炎組(慢乙肝組,10人)和健康對照組;驗證隊列包括3個組別:肝癌組(n=75,其中48例為新發(fā)肝癌,27例為肝癌術(shù)后患者)、肝硬化組(n=51)和慢乙肝組(n=14)。通過同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技術(shù)聯(lián)合高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-ESI-MS/MS)鑒定發(fā)現(xiàn)隊列中肝癌與非肝癌人群的尿液差異表達蛋白(Differentially expressed proteins,DEPs),然后使用組織特異性表達分析工具(Tissue specific expression analysis,TSEA)對這些尿DEPs進行組織來源分析,根據(jù)DEPs的變化倍數(shù)和一系列生物信息學(xué)方法(使用PANTHER數(shù)據(jù)庫進行功能富集實驗,使用STRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)),找出下一步研究的目標(biāo)蛋白。通過免疫印跡實驗(Western blot)驗證尿液中目標(biāo)蛋白是否存在以及分子量大小。通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定尿液中目標(biāo)蛋白的濃度。為明確AFP在HBV感染的肝癌細胞中的生物學(xué)功能,我們通過轉(zhuǎn)染靶向人AFP的shRNA慢病毒進入HepG2.2.15和HepGAD38細胞中,采用定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)和Western blot檢測AFP的敲低效率,然后通過MTT評估細胞增殖,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡,以及Transwell實驗測定細胞侵襲和遷移。統(tǒng)計分析:兩組目標(biāo)蛋白的濃度比較采用非參數(shù)檢驗的Mann-Whitney U檢驗進行分析,使用Pearson相關(guān)系數(shù)以確定兩個連續(xù)變量之間的相關(guān)性,使用受試者工作特征(Receiver operating characteristic,ROC)曲線來分析評估目標(biāo)尿蛋白診斷肝癌的效能,兩者ROC曲線比較采用Delong檢驗,P值小于0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果:通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及分析,我們共鑒定出了96個肝癌尿DEPs,其中74個上調(diào),22個尿蛋白下調(diào)。這些蛋白主要為分泌型蛋白,信號通路主要富集在血液凝固、CCKR信號通路、血纖維蛋白溶酶原激活級聯(lián)反應(yīng)。通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析,我們確定了15個關(guān)鍵蛋白,分別為:CP,FGA,AFP,CST3,TGOLN2,HSP90B1,VCAN,LTBP1,IGFBP7,ORM1,AMBP,FGB,ORM2,RBP4和CAMP,這些蛋白被認為在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。另外,我們通過與既往血液蛋白質(zhì)組學(xué)研究相比較,共有6個蛋白是血液和尿液中共有的,分別是:ORM1,LBP,ANPEP,GSN,AFP和SERPINA3,再整合變化倍數(shù)排前10位的DEPs,我們最終確定AFP和α1酸性糖蛋白(Orosomucoid 1,ORM1)作為我們后續(xù)的研究目標(biāo)蛋白。Western blot實驗證實尿液中確實存在AFP和ORM1蛋白,其對應(yīng)的條帶位置分別為70kd和45kd,與蛋白的實際分子量大小一致。通過對140例驗證隊列受試者尿液進行ELISA檢測,我們再次驗證了肝癌患者中存在相對較高濃度的u-AFP和u-ORM1。結(jié)果顯示:肝癌組u-AFP水平[109.9(3,3308.9)pg/ml]明顯高于肝硬化組[3(3,3)pg/ml,p=0.002]和肝炎組[3(3,3)pg/ml,p0.001]。u-AFP和血清AFP或AFP-L3存在強相關(guān)關(guān)系,皮爾森相關(guān)系數(shù)分別達0.673(p0.0001)和0.944(p0.0001),表明u-AFP可能來源于血液循環(huán)。肝癌組u-ORM1濃度[1370.6(522.2,10909.2)ng/ml]明顯高于肝硬化組[574.6(320,1056.4)ng/ml,p0.001],但與肝炎組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.286)。為評估兩者的臨床應(yīng)用價值,我們分別繪制了ROC曲線,u-AFP的ROC曲線下面積(AUC)為0.795(95%CI:0.706-0.886),當(dāng)設(shè)定診斷閾值為25.8pg/ml時,u-AFP診斷肝癌的敏感性為63.5%,特異性為95.4%。雖然u-ORM1診斷肝癌的效能較弱,其AUC為0.705(95%CI:0.604-0.807),但當(dāng)聯(lián)合u-AFP和u-ORM1時,其診斷效能明顯提升,AUC達到0.864(95%CI:0.791-0.937),敏感性為80.9%,特異性為85.5%。另外,我們對u-AFP和u-ORM1做了定性診斷分析,設(shè)定u-AFP大于3pg/ml為陽性,u-ORM1大于1284.9ng/ml為陽性。結(jié)果顯示:單獨u-AFP的陽性預(yù)測值為90.9%,并行聯(lián)合u-AFP和u-ORM1的診斷敏感性為85.1%,診斷效能較好,有望進一步開發(fā)為診斷試紙條。細胞功能實驗表明,敲除AFP可顯著抑制HBV感染細胞的增殖、侵襲和遷移。AFP敲低后,細胞上清液中的HBV-DNA下降了約50%,HBsAg無明顯變化,而HBeAg上升了約20%,表明AFP對HBV-DNA的復(fù)制有明顯的促進作用。AFP敲低促進了INFA1和下游基因的表達,包括OAS1,OAS2,ISG15和RNASEL。表明AFP有可能通過抑制IFNα信號通路促進HBV-DNA的復(fù)制,雖然這一結(jié)論需要得到更多實驗的證實。結(jié)論:尿AFP是肝癌的潛在診斷或篩查生物標(biāo)志物,聯(lián)合尿ORM1可提高其診斷效能,并有希望開發(fā)為診斷試紙條。AFP可以促進HBV感染的肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移,并且可能通過抑制IFNα信號傳導(dǎo)途徑促進HBV-DNA復(fù)制。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R735.7;R512.62
【部分圖文】：

圖 1.1 蛋白質(zhì)組學(xué)研究流程Figure 1.1. The proteomics workflow1.3 尿液樣本收集方案在充分告知受試者研究目的與可能的受益，得到受試者同意，并簽署知情同意書后，在尿液收集的前一晚，分發(fā) 50ml 無酶離心管，囑咐收集清晨首次中段尿于試管中，盡可能收集至 50ml。收集完后將樣本交予研究人員，研究人員將樣本置于冰盒，待當(dāng)日的樣本全部收集完畢后，運轉(zhuǎn)至重慶醫(yī)科大學(xué)病毒性肝炎研究所進行下一步的實驗。1.4 尿蛋白提取及定量1.4.1 尿蛋白濃縮（1） 首先將收集到的 50ml 尿液于 1000g 轉(zhuǎn)速、4℃條件下離心 10 分鐘，

圖 1.4 差異蛋白功能富集分析。通過運用 PANTHER 在線數(shù)據(jù)庫，96 個差異蛋白的主要功能通過基因本體論（包括細胞組分、分子功能、生物學(xué)過程）和信號通路反映出來。餅圖中每個顏色模塊大小代表的是指某一條目富集的蛋白數(shù)量占比。Figure 1.4 Function enrichment analysis of DEPs. By using the PANTHER online database, theprimary functions of 96 differential proteins are reflected by gene ontology (including cellularcomponents, molecular functions, biological processes) and signaling pathways. The size ofeach color module in the pie chart represents the proportion of protein enriched in an item.2.2.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)為進一步了解這些鑒定出的 96 個差異蛋白中哪些蛋白發(fā)揮著關(guān)鍵作用，我們創(chuàng)建了蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，如圖 1.5A。在此網(wǎng)絡(luò)中共有 78 個節(jié)點和 199 條連線，其中 18 蛋白未包含在此網(wǎng)絡(luò)中，是因為其與其他蛋白相互作用關(guān)系值小于 0.4。單個蛋白與其他蛋白連線數(shù)量越多，說明該蛋白越為關(guān)鍵。正是基于此，我們通過

a 插件將其中連線最多的 15 個蛋白從網(wǎng)絡(luò)中挑選出來（圖1.5B），紅色越深，說明連線越多。根據(jù)其連線數(shù)量，這 15 個蛋白的排序如下：CP，F(xiàn)GA，AFP，CST3，TGOLN2，HSP90B1，VCAN
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本文編號：2867613