發(fā)布時間：2020-10-29 23:27

　　 目的通過構(gòu)建表達(dá)HBx基因的小鼠模型,評估HBx誘導(dǎo)肝組織炎癥損傷的情況,分析程序性壞死和凋亡的作用,探討HBx誘導(dǎo)小鼠肝組織炎癥損傷的機(jī)制;用抗氧化劑NAC進(jìn)行干預(yù),分析NAC對HBx誘導(dǎo)的程序性壞死和凋亡的影響,探討NAC對HBx誘導(dǎo)的小鼠肝組織炎癥損傷的作用。方法(1)成年雄性ICR小鼠25只隨機(jī)平均分成HBx組、Control組、payw1.2組、payw*7組和Mock組,將質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-HBx、pcDNA3.1、pGEM-HBV(payw1.2)、pGEM-HBV-?HBx(payw*7)和轉(zhuǎn)染試劑通過尾靜脈快速注射到小鼠體內(nèi),24h后眼眶取血并取肝組織,RT-PCR和Western blot檢測肝組織中HBx mRNA和蛋白的表達(dá)情況,ELISA檢測血清中HBsAg的表達(dá)情況,ELISA和qPCR分別檢測血清和肝組織中TNF-α的表達(dá)情況,組織切片行HE染色觀察肝臟的組織學(xué)形態(tài),qPCR檢測肝組織中RIP3、JNK、Bcl-2/Bax、Caspase8、Caspase3 mRNA的表達(dá)情況,Western blot檢測肝組織中RIP3、JNK和磷酸化JNK蛋白的表達(dá)情況;(2)成年雄性ICR小鼠16只隨機(jī)平均分成HBx組、HBx+NAC組、pc組和pc+NAC組,將質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-HBx、pcDNA3.1和轉(zhuǎn)染試劑通過尾靜脈快速注射到小鼠體內(nèi),干預(yù)組在轉(zhuǎn)染前0.5h腹腔注射NAC,轉(zhuǎn)染24h后取肝組織,RT-PCR檢測肝組織中HBx mRNA的表達(dá)情況,qPCR檢測肝組織中TNF-α、RIP3、JNK、Bcl-2/Bax、Caspase8、Caspase3 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果(1)RT-PCR和Western blot結(jié)果均顯示HBx組肝組織中有HBx基因的表達(dá);ELISA結(jié)果顯示payw1.2組和payw*7組血清中均有HBsAg的表達(dá),且payw1.2組較payw*7組有所上調(diào)(P0.05),HBx組血清中TNF-α的表達(dá)較Control組顯著上調(diào)(P0.0001),payw1.2組與payw*7組無明顯差異;qPCR結(jié)果顯示HBx組肝組織中TNF-α、RIP3的表達(dá)較Control組明顯上調(diào)(P0.01),JNK、Bcl-2的表達(dá)也有所上調(diào)(P0.05),Caspase8、Caspase3的表達(dá)下調(diào)(P0.05),Bax的表達(dá)無明顯差異,payw1.2組肝組織中TNF-α、Bcl-2的表達(dá)較payw*7組上調(diào)(P0.05),RIP3、JNK、Bax、Caspase8、Caspase3的表達(dá)均無明顯差異;組織切片HE染色結(jié)果顯示除Control組外各組肝組織均有不同程度的病理學(xué)改變;Western blot結(jié)果顯示HBx組肝組織中RIP3的表達(dá)較Control組明顯上調(diào)(P0.01),JNK的表達(dá)水平無明顯差異但磷酸化水平上調(diào),payw1.2組與payw*7組的RIP3、JNK表達(dá)水平和JNK磷酸化水平均無明顯差異;(2)RT-PCR結(jié)果顯示HBx+NAC組和HBx組肝組織中均有HBx基因的表達(dá);qPCR結(jié)果顯示pc+NAC組肝組織中Bcl-2的表達(dá)較pc組明顯上調(diào)(P0.01),Caspase3的表達(dá)顯著下調(diào)(P0.001),TNF-α、RIP3、JNK、Bax、Caspase8的表達(dá)均無明顯差異;HBx+NAC組肝組織中RIP3的表達(dá)較HBx組明顯下調(diào)(P0.01),TNF-α、Bcl-2、Caspase3的表達(dá)也有所下調(diào)(P0.05),Bax的表達(dá)顯著上調(diào)(P0.001),Caspase8的表達(dá)也有所上調(diào)(P0.05),JNK的表達(dá)無明顯差異;HBx+NAC組肝組織中JNK、Bax的表達(dá)較pc+NAC組明顯上調(diào)(P0.01),TNF-α、RIP3的表達(dá)也有所上調(diào)(P0.05),Bcl-2、Caspase8、Caspase3的表達(dá)均無明顯差異。結(jié)論HBx可以促進(jìn)HBV的復(fù)制,并通過誘導(dǎo)程序性壞死和抑制凋亡介導(dǎo)小鼠肝組織的炎癥損傷;NAC可以抑制HBx誘導(dǎo)的程序性壞死,從而減輕小鼠肝組織的炎癥損傷。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R575;R512.62
【部分圖文】：

圖 1.1 各組小鼠肝組織 HBx mRNA 表達(dá)情況織 HBx 蛋白表達(dá)情況ot 結(jié)果示，HBx 組、Control 組和 Mock 組內(nèi)參 HBx 蛋白表達(dá)的條帶，Control 組和 Mock 組圖 1.2 各組小鼠肝組織 HBx 蛋白表達(dá)情況 HBsAg 表達(dá)情況示，payw1.2組與payw*7組均可檢測到HBsAg

圖 1.2 各組小鼠肝組織 HBx 蛋白表達(dá)情況3.3 小鼠血清 HBsAg 表達(dá)情況ELISA結(jié)果示，payw1.2組與payw*7組均可檢測到HBsAg表達(dá)，且payw的表達(dá)水平較 payw*7 組上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（*P<0.05）（見圖 1.payw1.2payw*7010203040BHsAg(U/ml)payw1.2payw*7*

HBxControlpayw1.2payw*70.0000.0020.0040.006ReatilevmRNAevelJ(KN/βa-tcin)payw1.2payw*7圖 2.6 各組小鼠肝組織 JNK mRNA 表達(dá)情況（2）Western blot 結(jié)果示，HBx 組、Control 組、payw1.2 組與 payw*7組小鼠肝組織中均可檢測到 JNK 和磷酸化 JNK 表達(dá)，HBx 組 JNK 的表達(dá)水平較Control 組無明顯差異，但磷酸化水平上調(diào)；payw1.2 組與 payw*7 組 JNK 的表達(dá)水平和磷酸化水平均無明顯差異(見圖 2.7）
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2861620