研究目的:擬根據(jù)HBV(Hepatitis B virus,HBV)感染細(xì)胞的關(guān)鍵事件,探討家蠅抗菌肽Cecropin(Musca domestica cecropin,MDC)抗HBV感染作用機(jī)制;外泌體作為細(xì)胞間交流的新方式,可攜帶病毒感染相關(guān)生物學(xué)信息,對(duì)病毒感染最終的結(jié)局有著重要的影響,本實(shí)驗(yàn)旨在探索HepG2.2.15細(xì)胞上清來源的外泌體是否介導(dǎo)HBV感染,MDC是否干預(yù)外泌體介導(dǎo)的HBV感染過程。研究方法:1.家蠅抗菌肽Cecropin抗HBV作用機(jī)制研究:(1)Hi-Trap肝素親和層析柱法純化HBV顆粒;電鏡負(fù)染觀察HBV形態(tài)。(2)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)HepaRG細(xì)胞增殖影響;12天感染實(shí)驗(yàn)中利用Real-time PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDC對(duì)HBV黏附/進(jìn)入及進(jìn)入后階段的影響;激光共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HBV黏附細(xì)胞階段加入藥物對(duì)感染率的影響;MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞毒性作用,Real-time PCR、ELISA、激光共聚焦顯微鏡及Western blotting檢測(cè)MDC對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制的影響。(3)激光共聚焦顯微鏡觀察MDC在細(xì)胞內(nèi)分布及定位;Real-time PCR、Western blotting檢測(cè)MDC對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路的影響。2、家蠅抗菌肽Cecropin抑制外泌體介導(dǎo)的HBV感染作用研究:(1)試劑盒提取HepG2.2.15細(xì)胞上清中外泌體(HepG2.2.15-EXO);電鏡負(fù)染檢測(cè)外泌體形態(tài),納米顆粒跟蹤分析儀檢測(cè)外泌體粒徑,Western blotting檢測(cè)外泌體標(biāo)志性蛋白,PCR技術(shù)檢測(cè)外泌體是否含HBV核酸成分;超高分辨率活細(xì)胞3D顯微成像儀觀察外泌體在細(xì)胞內(nèi)的定位;(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外泌體在細(xì)胞中的擴(kuò)散與傳遞,ELISA,Real-time PCR,ICC,Western blotting檢測(cè)HepG2.2.15-EXO是否介導(dǎo)HBV的感染,及探討MDC是否干預(yù)外泌體介導(dǎo)的HBV感染;(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外泌體濃度、共同孵育時(shí)間溫度、肝素及肝素酶對(duì)外泌體在細(xì)胞間擴(kuò)散傳遞的影響;Real-time PCR檢測(cè)肝素及肝素酶對(duì)細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA的表達(dá)影響;研究結(jié)果:1、家蠅抗菌肽Cecropin抗HBV作用機(jī)制研究:(1)電鏡觀察顯示MDC作用后HBV顆粒結(jié)構(gòu)破壞,并發(fā)生凝集反應(yīng);(2)在HBV攻擊細(xì)胞前或后加入藥物干預(yù),結(jié)果顯示MDC能使細(xì)胞HBV相關(guān)指標(biāo)(細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA,HBVcccDNA,pgRNA含量)降低,在HBV的黏附/進(jìn)入及進(jìn)入后階段均發(fā)揮了抑制作用;MDC可顯著降低HepG2.2.15細(xì)胞上清中HBsAg、HBeAg抗原及HBV DNA含量,細(xì)胞內(nèi)HBsAg、HBcAg蛋白含量,具有抑制HBV復(fù)制作用。(3)激光共聚焦顯微鏡觀察顯示MDC作用位點(diǎn)主要在細(xì)胞膜,細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核也有結(jié)合;且MDC能激活JAK/STAT抗病毒信號(hào)通路,發(fā)揮抗病毒作用。2、家蠅抗菌肽Cecropin抑制外泌體介導(dǎo)的HBV感染作用研究:(1)對(duì)試劑盒法提取的外泌體,進(jìn)行電鏡形態(tài)學(xué)檢測(cè),納米顆粒跟蹤技術(shù)的粒徑檢測(cè),及外泌體標(biāo)志性蛋白檢測(cè),確定提取的為外泌體,可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);PCR技術(shù)核酸檢測(cè)顯示外泌體中存在HBV核酸;(2)流式細(xì)胞術(shù)、ELISA、ICC、Western blotting及Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)外泌體共同孵育的正常肝細(xì)胞HBV呈陽性表達(dá),而家蠅抗菌肽Cecropin作用后,上述細(xì)胞內(nèi)HBV相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)顯著降低;(3)外泌體濃度、共同孵育時(shí)間、共同孵育溫度、肝素、肝素酶對(duì)外泌體在細(xì)胞間擴(kuò)散傳遞有一定影響。結(jié)論:家蠅抗菌肽Cecropin可破壞HBV病毒顆粒結(jié)構(gòu),并使其發(fā)生凝聚;此外其對(duì)HBV病毒生命周期中的黏附/進(jìn)入階段及進(jìn)入后的復(fù)制階段均有抑制作用;MDC可通過激活抗病毒信號(hào)通路,發(fā)揮其抗病毒作用;提示MDC抗HBV作用機(jī)制復(fù)雜,涉及多個(gè)靶點(diǎn);此外HepG2.2.15細(xì)胞上清來源的外泌體可介導(dǎo)HBV感染,而MDC對(duì)外泌體介導(dǎo)的HBV感染具有顯著抑制作用。
【學(xué)位單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

圖 1-1 HBV 生命周期圖1.1.2 外泌體外泌體是一種可以由大多數(shù)細(xì)胞所分泌的，直徑約為 30-150 nm 的微小囊泡，其表面結(jié)構(gòu)富含脂類物質(zhì)，其內(nèi)可攜帶多種核酸、蛋白質(zhì)等生物信息[20-21]。外泌體穿梭在細(xì)胞與細(xì)胞間，扮演著物質(zhì)運(yùn)輸與信息交流的作用，參與到多種生理學(xué)及病理學(xué)過程，如細(xì)胞生長增殖分化，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及疾病細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸?shù)萚22-23]。有研究報(bào)道，外泌體在肝臟疾病中也發(fā)揮著重要作用[24-25]。在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，外泌體所攜帶的相關(guān)核酸、蛋白等成分也發(fā)生相應(yīng)的改變，因此，外泌體在肝臟疾病進(jìn)程中也有望被用作生物標(biāo)記物，來指導(dǎo)肝臟疾病的診斷治療[26]。其發(fā)揮交流溝通的機(jī)制可能是外泌體與靶細(xì)胞相關(guān)受體結(jié)合、內(nèi)含物改變受體細(xì)胞微環(huán)境、最終調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理進(jìn)程。因此加強(qiáng)對(duì)細(xì)胞外排的外泌體的探討，對(duì)進(jìn)一步了解原分泌細(xì)胞的生物學(xué)活性及指導(dǎo)疾病診斷治療有重要意義[27]。外泌體由原細(xì)胞分泌釋放到外環(huán)境中，通過各種途徑被靶細(xì)胞所吸收，這個(gè)過程并非隨機(jī)發(fā)生，細(xì)胞特異性是否參與到其中的特異性吸收過程，也仍是研究的一個(gè)方向[28]。

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文結(jié)果蠅抗菌肽 Cecropin 直接作用于病毒顆粒集 HepG2.2.15 細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)胞上清，每 100 mL 上清按操，純化過程及定量結(jié)果分別見圖 2-2、表 2-1。HBV 顆粒與濃度為菌肽 Cecropin（MDC）直接作用后，病毒顆粒的形態(tài)變化如圖 2，HBV 顆粒表面結(jié)構(gòu)遭到破壞，并且家蠅抗菌肽 Cecropin 處理組。

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文原細(xì)胞上清 肝素管純化液 第一次超濾液 第二次超濾液1 M NaCl 20 mMTris-HCl 第二管1 M NaCl 20 mMTris-HCl 第二管1 M NaCl 20 mMTris-HCl 第二管體積 100 mL 50 mL 1.8 mL 0.8 mLHBVcopies/μl1912 200.2 158.4 稀釋 10 倍后為 502.41 M NaCl 20 mMTris-HCl 第一三管1 M NaCl 20 mMTris-HCl 第一三管1 M NaCl 20 mMTris-HCl 第一三管體積 100 mL 5.8 mL 1.2 mLHBVcopies/μl135.2 901.3 稀釋 10 倍后為 743
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本文編號(hào)：2861006