研究目的:由乙型肝炎病毒持續(xù)感染引起的慢性乙型肝炎及繼發(fā)的肝硬化和肝癌是威脅人類健康的重大疾病。α干擾素(Interferon-α,IFN-α)是目前治療乙肝的一個(gè)主要方法,但在臨床治療中缺乏廣譜的療效。黏病毒抗性蛋白A(myxovirus resistance protein A,MxA)是干擾素誘導(dǎo)的重要抗病毒蛋白,其具有不依賴干擾素信號且獨(dú)立抗乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)的功能,但其抗HBV的作用機(jī)制尚未被充分闡明。我們前期研究發(fā)現(xiàn),MxA蛋白通過與病毒核心蛋白(hepatitis B core protein,HBc)相互作用抑制HBV復(fù)制,我們推測MxA可能對HBV核衣殼的組裝有抑制作用。本研究將進(jìn)一步闡明MxA蛋白抑制HBV復(fù)制的分子機(jī)制,這為研發(fā)抗HBV新藥提供了靶點(diǎn)和理論支持,同時(shí),此項(xiàng)研究也將為突破現(xiàn)今干擾素治療不應(yīng)答的瓶頸提供新的技術(shù)手段和依據(jù)。研究方法:以HepG2.2.15細(xì)胞為病毒模型,將Flag空載、Flag-MxA、突變體Flag-MxAK83A和突變體Flag-MxAL612K分別轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞,利用Western印跡法檢測核心抗原蛋白HBc表達(dá)情況,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測核衣殼內(nèi)pgRNA的量。透射電鏡觀察在HuH7細(xì)胞中單轉(zhuǎn)Flag-HBc、共轉(zhuǎn)Myc-MxA與Flag-HBc核心顆粒的形態(tài)。將Myc-MxA分別與Flag-HBc和突變體Flag-HBc-Y132A共轉(zhuǎn)染HuH7細(xì)胞,利用免疫共沉淀法檢測相互作用。以Myc-MxA為模板構(gòu)建缺失突變體ΔCID(central interactive domain)和截短體CID,分別將空載質(zhì)粒、MxA、ΔCID和CID轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞免疫熒光法檢測轉(zhuǎn)染效率,Western印跡法檢測質(zhì)粒表達(dá)情況,酶聯(lián)免疫法測定細(xì)胞上清液中HBsAg、HBeAg及熒光定量PCR法測定上清液中HBV DNA的量,鑒定CID段的抗乙肝病毒活性。根據(jù)CID段的晶體結(jié)構(gòu),分別構(gòu)建A1、A2、A3等9段肽段質(zhì)粒,鑒定各段的抗乙肝病毒活性。運(yùn)用計(jì)算生物學(xué)手段—分子對接法預(yù)測MxA蛋白與病毒相互作用的區(qū)域和位點(diǎn)。根據(jù)篩選結(jié)果構(gòu)建缺失突變體,檢測突變體的抗病毒活性,以此鑒定MxA蛋白上與HBc相互作用關(guān)鍵區(qū)段。研究結(jié)果:野生型Flag-MxA、突變體Flag-MxAK83A和突變體Flag-MxAL612K較空載對照組HBc含量無明顯變化,較pgRNA的量顯著下降(P0.01)。透射電鏡結(jié)果顯示,與單轉(zhuǎn)HBc組相比,MxA表達(dá)組核衣殼出現(xiàn)明顯聚集、變形。免疫共沉淀結(jié)果顯示,MxA蛋白能與HBc共沉淀也能與HBc-Y132A共沉淀,兩者均與MxA蛋白有相互作用。ΔCID、CID和9段肽段質(zhì)粒的測序及表達(dá)正確。CID組和MxA組較空載對照組HBsAg、HBeAg及HBV DNA含量均顯著降低(P0.01),ΔCID組較對照組無明顯變化。9段肽段中A1較對照HBsAg、HBeAg及HBV DNA的量下降最顯著(P0.001)。分子對接的結(jié)果顯示,MxA蛋白上與病毒HBc蛋白的互作位點(diǎn)集中在384-408位氨基酸,該區(qū)域落在A1肽段上。Δ384-408組與空白組相比,抗病毒活性無明顯變化,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)論:MxA蛋白對HBV的核心蛋白HBc的表達(dá)無影響;MxA蛋白阻礙HBV核衣殼的組裝;MxA蛋白主要通過與未組裝的核心蛋白HBc相互作用來抑制核衣殼的組裝;MxA蛋白可能主要以A1區(qū)段與核心蛋白HBc的相互作用來阻礙核衣殼的裝配,從而抑制病毒復(fù)制。
【學(xué)位單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

摘自(Gao,etal.2010)

摘自(Li,etal.2012）

MxA 蛋白和組裝前的核心蛋白相互作用 在 HuH7 細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染 Flag-veMxA、Flag-HBc 與 Myc-ΔCID、Flag-HBc 與 Myc-MxA、Flag-HBc-Y132A 與 Myc-裂解各組細(xì)胞，用 anti-Flag 抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，用 anti-Myc 檢測共沉的 M Interaction between MxAprotein and core protein before assembly Flag-vector andMxA, Flag-HBc and Myc-ΔCID, Flag-HBc and Myc-MxA, Flag-HBc-Y132A and Myc-Mco-transfected into HuH7 cells, respectively, and the cells were lysed after 24 h. Themunoprecipitation experiment was carried out with an anti-Flag antibody, and themunoprecipitation MxA protein was detected with anti-Myc.xA 蛋白上 CID 區(qū)是抑制乙肝病毒復(fù)制的有效區(qū)段基于我們前期研究的發(fā)現(xiàn)：CID 結(jié)構(gòu)域缺失，MxA 蛋白完全喪失抗 HBV363-574aa）對 MxA 抗 HBV 必不可少[19]，提示 CID 可能是 MxA 蛋白上與作用發(fā)揮抗 HBV 的有效區(qū)段。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們以 Myc-MxA 全長
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本文編號：2858896