隱匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection,OBI)是特殊的HBV感染形式。由于OBI攜帶者血液中HBsAg呈陰性,因而臨床上很少被識別,也未納入乙肝診療的范圍。但是越來越多的證據(jù)表明其可能影響HBV慢性感染的結(jié)局,甚至導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。關(guān)于OBI的發(fā)生機(jī)制未有定論,其中可能的因素為病毒本身的改變,因此本研究基于前期大量樣本的分析,從病毒角度探索HBVS蛋白的突變和修飾在OBI發(fā)生中的作用。2010年1月至2013年12月間,本實(shí)驗(yàn)室收集了來自全國各地29個(gè)血站的1261份HBsAg-/HBVDNA+獻(xiàn)血者樣本,確認(rèn)了其中982例為OBI。我們對970例信息完全的OBI獻(xiàn)血者宿主或病毒信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并按照血清學(xué)狀態(tài)進(jìn)行分組統(tǒng)計(jì)。隨機(jī)抽取275份OBI樣本進(jìn)行S區(qū)測序,成功測序116份。同期還在同一人群中成功測序530份HBsAg陽性樣本用作對照組。本研究從S蛋白的糖基化和跨膜結(jié)構(gòu)域突變兩個(gè)方面對116份OBI和531份對照序列比對分析,識別候選突變并對候選突變進(jìn)行功能驗(yàn)證。研究方法采用定點(diǎn)突變技術(shù)將候選突變引入目標(biāo)野生型質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染到huh-7表達(dá),檢測細(xì)胞內(nèi)外表面抗原的水平,并用WB進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示970例確認(rèn)的OBI獻(xiàn)血者男性占70%,重復(fù)獻(xiàn)血者占39.7%,中位年齡為40歲(范圍18-60歲),未見ALT異常案例。絕大部分(69.1%)樣本的HBV DNA 水平低于 12 IU/mL。血清學(xué)模式分為 anti-HBc+/anti-HBs-占 68%(659),anti-HBc+/anti-HBs+占 25%(242),anti-HBc-/anti-HBs+占 7%(69)。測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),OBI組S蛋白糖基化突變(40.7%vs 11.8%,P0.001)和TMD區(qū)親水性氨基酸替換頻率(65%vs 25%,P0.001)高于HBsAg陽性對照組。我們選取MHR區(qū)的7個(gè)位點(diǎn)的9個(gè)新增糖基化突變和3個(gè)廢除糖基化突變進(jìn)行功能驗(yàn)證。WB結(jié)果顯示除了 GSS112-114NAT其他突變?nèi)砍晒σM(jìn)新的糖基。在質(zhì)粒M88和p38.Ⅱ上,除了 TCT123-125NCT/NFT,其他突變并未顯著改變胞外HBsAg水平。對于質(zhì)粒M86,所有新增糖基化突變導(dǎo)致胞外HBsAg下降到野生型的1/10甚至1/1000,廢除146位點(diǎn)糖基化突變導(dǎo)致胞外HBsAg上升至10倍左右,分泌效率(胞內(nèi)胞外HBsAg之比)與胞外HBsAg有一致的變化。另外,我們選取TMD1-3區(qū)7個(gè)R替換進(jìn)行功能驗(yàn)證,結(jié)果表明TMD2中的R替換使胞外胞內(nèi)HBsAg降至檢測限以下,而TMD1和TMD3中的R替換沒有導(dǎo)致HBsAg顯著變化。綜上,新增糖基化突變通過阻礙分泌而導(dǎo)致胞外HBsAg下降,TMD2區(qū)的親水性氨基酸替換導(dǎo)致胞內(nèi)外極低的HBsAg水平,從而導(dǎo)致血液循環(huán)中無法檢測到HBsAg,因而很可能是OBI的發(fā)生的機(jī)制之一。本研究為更全面的闡明病毒因素在OBI發(fā)生中發(fā)揮的作用提供了新的角度和證據(jù),為OBI的深入研究奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

在且具有致病性及傳染性。當(dāng)感染者處于免疫抑制狀態(tài)下，ＨＢＶ再激活的出現(xiàn)??也是ＯＢＩ的一大臨床危害［７，８］。另外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群分析等多項(xiàng)研宄都證明ＯＢＩ??是發(fā)生慢性肝臟疾病和肝癌的重要危險(xiǎn)因素（圖１）。??但由于ＯＢＩ感染者無癥狀或者癥狀不明顯，且血清ＨＢｓＡｇ陰性，ＨＢＶＤＮＡ??含量極低，很難被發(fā)現(xiàn)，因此相關(guān)臨床研宄受到限制。血清學(xué)檢測，尤其是ＨＢｓＡｇ??檢測一直是一項(xiàng)重要的血液篩查手段，但隨著對輸血安全越來越高的要求，以及對??ＯＢＩ這一特殊感染狀態(tài)的認(rèn)識，單純的血清學(xué)檢測的靈敏度已經(jīng)不能滿足控制ＨＢＶ??輸血傳播風(fēng)險(xiǎn)的需求。因此２００４年起核酸檢測（Ｎｕｃｌｅｉｃ?ａｃｉｄ?ｔｅｓｔ，?ＮＡＴ）開始在發(fā)??達(dá)國家血液中心得到應(yīng)用。２０１０年起，ＮＡＴ開始在我國各血站得到應(yīng)用，國家衛(wèi)??生健康委臨床檢驗(yàn)中心（原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心）同時(shí)開始對全國血站ＮＡＴ檢測??５??

轉(zhuǎn)錄后機(jī)制和翻譯后修飾的研究更少。??Ｓ區(qū)除了?ＭＨＲ，剩余部分組成了?４個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ?ｄｏｍａｉｎｓ，??ＴＭＤｓ）和一個(gè)外膜內(nèi)ｌｏｏｐ?（圖２）。ＴＭＤ的結(jié)構(gòu)及位置見圖２，?ＴＭＤ?１?（ａａ４？ａａ２３）??和ＴＭＤ?２?（ａａ８１？９９）是已被證實(shí)的兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，而１６０－２２６這一區(qū)域的拓?fù)??結(jié)構(gòu)還未證實(shí)，但是這一區(qū)域絕大部分是疏水性的，尤其富含芳香族氨基酸，因此??推測這一區(qū)域包含兩個(gè)ａ螺旋，形成兩個(gè)ＴＭＤ，?ＴＭＤ３（ａａｌ６０？ａａｌ９３）和ＴＭＤ４??（ａａ２０２？ａａ２２２）＿。ＴＭＤ絕大部分由疏水性氨基酸組成，這種疏水特性使其插入脂??質(zhì)雙分子層，從而將Ｓ蛋白鉚釘在病毒外膜上。因此，ＴＭＤ的疏水特性一旦受到??破壞很可能對Ｓ蛋白的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要影響而導(dǎo)致血液循環(huán)中不可檢測到的??ＨＢｓＡｇ，可能導(dǎo)致ＯＢＩ的發(fā)生［２３］。ＳｕｂｈａｊｉｔＢｉｓｗａｓ等發(fā)現(xiàn)ＴＭＤ?３區(qū)的Ｐ１７８Ｒ突變??導(dǎo)致ＨＢｓＡｇ分泌受阻，從而使胞外ＨＢｓＡｇ呈低水平［１４］，?ＯＢＩ中ＴＭＤ區(qū)其他突變??至今尚未見報(bào)道

?ＴＣＴ１２３－１２５ＮＦＴ，?ＧＴＳ１３０－１３２ＮＴＳ，?ＴＳＭ１３１－１３３ＮＳＳ，?ＴＳＭ１３１－１３３ＮＳＴ，??ＴＳＭ１３１－１３３ＮＹＴ，廢除糖基化包括ＮＣＴ１４６－１４８ＤＣＴ，詳見圖３�；蛐停弥凶R別??出的新增糖基化突變包括：ＴＴＳ１１５－１１７ＮＴＳ，ＴＣＴ１２３－１２５ＮＣＴ，ＧＴＳ１３０－１３２ＮＴＳ，??ＴＳＭ１３１－１３３ＮＳＴ，?ＴＳＭ１３１－１３３ＮＹＴ，廢除糖基化包括?ＮＣＴ１４６－１４８ＤＣＴ／ＳＣＴ／ＹＣＴ，??詳見圖４。??精氨酸側(cè)鏈均有氨基，在非堿性環(huán)境中以－ＮＨ３＋存在，是帶有大正電荷的親水??性氨基酸，親水性在所有氨基酸中最高，最可能破壞ＴＭＤ的疏水特性。因此，識??別４個(gè)ＴＭＤ區(qū)的Ｒ替換進(jìn)行功能驗(yàn)證�；蛐停轮邪ǎ海裕停模眳^(qū)Ｑ１６Ｒ，ＴＭＤ２??區(qū)Ｃ８５Ｒ和Ｌ８８Ｒ，ＴＭＤ３區(qū)Ｑ１８１Ｒ和Ｗ１８２Ｒ，詳見圖３�；蛐停弥邪ǎ海裕停模�??區(qū)?Ｌ８７Ｒ?和?Ｃ９０Ｒ，ＴＭＤ３?區(qū)?Ｑ１８１Ｒ?和?Ｗ１８２Ｒ，詳見圖?４。??４?
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本文編號：2838612