本文關(guān)鍵詞：Galectin蛋白家族在伯氏瘧原蟲感染急性肺損傷小鼠模型中的作用機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：1.研究背景瘧疾仍然是一種嚴(yán)重危害全球健康的重大傳染病。瘧原蟲感染可導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床表現(xiàn),其中瘧疾相關(guān)性急性肺損傷(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是有較高發(fā)病率和極高死亡率的重癥瘧疾。近年來,人們開始更多地關(guān)注瘧疾患者的肺部病變?nèi)鏏LI和ARDS。ALI的病理生理變化往往出現(xiàn)在腦型瘧疾癥狀之前,表現(xiàn)為炎癥介導(dǎo)的內(nèi)皮損傷和毛細(xì)血管通透性增加導(dǎo)致的彌漫性肺泡破壞,并且這種損傷可持續(xù)到用藥物治療清除寄生蟲之后[1]。然而,到目前有關(guān)瘧疾相關(guān)ALI/ARDS的免疫病理機(jī)制卻鮮有報(bào)道。galectin蛋白家族是在先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起重要作用的一種高度保守的聚糖結(jié)合蛋白家族,其中g(shù)alectin-1、3、8和9在肺組織病理生理過程中發(fā)揮著重要作用[2-5],其中g(shù)alectin-9/Tim-3通路在病毒、細(xì)菌及寄生蟲感染過程中均發(fā)揮著重要的作用。galectin-9與其天然受體Tim-3結(jié)合可特異性地抑制Th1和Th17細(xì)胞的免疫反應(yīng)[6]。此外,galectin-9還可與其他受體(CD44、CD137和PDI)結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)功能[7-9]。然而,galectin-9及其受體在瘧疾相關(guān)ALI中扮演的角色目前尚不清楚。2.研究目的和意義本研究旨在探討乳糖封閉galectin蛋白家族后對(duì)伯氏瘧原蟲感染急性肺損傷的作用機(jī)制。我們的結(jié)果表明galectin-9及其受體在瘧疾相關(guān)ALI的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。3.第一部分1)材料和方法(1)建立小鼠模型雌性昆明小鼠腹腔內(nèi)注射106個(gè)Plasmodium berghei ANKA(Pb ANKA)感染的紅細(xì)胞,以建立瘧疾相關(guān)ALI小鼠模型。每日監(jiān)測死亡率。(2)血蟲率檢測對(duì)Pb ANKA感染小鼠作尾血涂片,姬姆薩染色,每天鏡檢監(jiān)測血蟲率。(3)組織病理檢測CO2吸入法處死小鼠,取小鼠的肺和縱膈淋巴結(jié)(mediastinal lymph nodes,MLNs)進(jìn)行HE(hematoxylin and eosin)染色,并評(píng)估組織學(xué)變化。(4)免疫組化染色使用SABC法對(duì)肺組織和MLNs進(jìn)行g(shù)alectin-9和Tim-3免疫組化染色。陽性細(xì)胞呈暗褐色。(5)細(xì)胞因子檢測使用q RT-PCR技術(shù)檢測小鼠肺和MLNs中g(shù)alectin-9、Tim-3、TNF-α、IL-6、IL-10的m RNA表達(dá)水平。2)結(jié)果(1)瘧疾相關(guān)ALI小鼠模型的建立Pb ANKA感染小鼠在感染后8-22天死亡:其中32%的小鼠在感染后8-10天死亡并表現(xiàn)出重癥瘧疾癥狀與神經(jīng)系統(tǒng)體征;其余小鼠在感染后18-22天死亡并表現(xiàn)為高血蟲率和呼吸窘迫。感染小鼠死亡前的BALF總蛋白含量顯著升高,提示肺泡-毛細(xì)血管膜屏障的破壞并出現(xiàn)ALI。(2)肺和MLN組織病理變化瘧原蟲感染小鼠的肺組織呈現(xiàn)中度至重度的炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡水腫、出血和肺泡隔的增厚。感染小鼠的MLNs表現(xiàn)為正常結(jié)構(gòu)(皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū))的破壞。(3)瘧原蟲感染小鼠肺和MLN組織galectin-9和Tim-3免疫組織化學(xué)染色小鼠在感染后5、10、15和20天肺部和MLN組織中g(shù)alectin-9和Tim-3染色陽性細(xì)胞顯著增加。(4)瘧原蟲感染小鼠肺和MLN組織galectin-9和Tim-3 m RNA表達(dá)感染小鼠肺組織galectin-9 m RNA的表達(dá)在感染后5、10、15和20天顯著上調(diào),MLNs中g(shù)alectin-9 m RNA的表達(dá)在感染后15和20天顯著上調(diào)。感染小鼠肺和MLNs中Tim-3 m RNA的表達(dá)均在感染后10、15和20天顯著上調(diào)。(5)肺和MLN組織中促炎和抗炎性細(xì)胞因子的表達(dá)與對(duì)照組相比,肺組織TNF-α表達(dá)水平在感染后15天顯著增加,但MLN組織TNF-α表達(dá)水平在感染后5、10、20天顯著降低。與對(duì)照組相比,肺組織IL-6m RNA表達(dá)在感染后10、15、20天顯著增加,MLN組織IL-6 m RNA表達(dá)在感染后5和10天顯著增加。與對(duì)照組相比,肺和MLN組織IL-10 m RNA表達(dá)在感染后10、15、20天顯著增加。2)結(jié)論在用Pb ANKA感染昆明小鼠建立了瘧疾相關(guān)ALI小鼠模型的基礎(chǔ)上,我們發(fā)現(xiàn)感染小鼠肺和MLN組織中的Galectin-9和Tim-3陽性細(xì)胞數(shù)量較正常對(duì)照組顯著增加;Galectin-9和Tim-3 m RNA在感染小鼠肺和MLN組織中高表達(dá),結(jié)果提示Galectin-9/Tim-3通路在瘧疾相關(guān)ALI模型中可能發(fā)揮著作用。4.第二部分1)材料和方法(1)建立小鼠模型雌性昆明小鼠腹腔內(nèi)注射106個(gè)Plasmodium berghei ANKA(Pb ANKA)感染的紅細(xì)胞,以建立瘧疾相關(guān)ALI小鼠模型。一部分感染小鼠腹腔內(nèi)注射300 m Mα-乳糖溶液100μl/次,從感染后第1天開始,每天兩次。每日監(jiān)測小鼠一般狀況。(2)血蟲率檢測對(duì)Pb ANKA感染小鼠作尾血涂片,姬姆薩染色,每天鏡下檢測血蟲率。(3)組織病理檢測CO2吸入法處死小鼠,取小鼠的肺組織進(jìn)行HE染色,并評(píng)估組織學(xué)變化。(4)免疫組化染色使用SABC法對(duì)各組小鼠肺組織進(jìn)行CD68免疫組化染色。陽性細(xì)胞呈暗褐色。(5)細(xì)胞因子檢測使用q RT-PCR技術(shù)檢測小鼠肺和MLNs中g(shù)alectin-1、3、8和9,galectin-9的受體Tim-3、CD44、CD137和PDI,Tim-3的另一配體HMGB1和CD44的另一配體透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)的相關(guān)酶HAS1-3(Hyaluronan synthases),IL-4、IL-10、IFN-α、β和γ的m RNA表達(dá)水平。(6)免疫熒光染色對(duì)小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的細(xì)胞成分和小鼠肺組織進(jìn)行CD68和galectin-9以及CD68和Tim-3免疫熒光雙染。CD68陽性單核巨噬細(xì)胞顯綠色熒光,galectin-9和Tim-3陽性細(xì)胞顯紅色熒光,雙染陽性細(xì)胞呈現(xiàn)黃色。(7)細(xì)胞凋亡檢測用TUNEL法檢測肺石蠟切片的細(xì)胞凋亡變化。(8)腹腔巨噬細(xì)胞的分離和培養(yǎng)從KM小鼠腹腔分離巨噬細(xì)胞并與5×106個(gè)Pb ANKA感染的紅細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)。為阻斷自分泌galectin分子與其受體的結(jié)合,在加入Pb ANKA感染紅細(xì)胞之前將細(xì)胞置于含30m Mα-乳糖的培養(yǎng)基中孵育1小時(shí)。樣品儲(chǔ)存在-80℃作進(jìn)一步分析。2)結(jié)果(1)乳糖阻斷增加瘧原蟲感染小鼠BALF總蛋白含量、血蟲率和死亡率乳糖阻斷感染組小鼠感染后7天死亡率為100%,顯著高于單感染組小鼠。相比單感染組小鼠,阻斷組小鼠BALF總蛋白含量在感染后5天和7天均顯著更高;血蟲率在第4、5和6天顯著增高;肺組織蟲荷在感染后5天顯著增高。(2)乳糖阻斷加重瘧原蟲感染小鼠病理損傷與單感染組小鼠相比,在感染后5天和7天乳糖阻斷感染組小鼠肺部炎癥顯著加重,淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤增加。(3)感染小鼠肺和MLN組織中g(shù)alectins、galectin-9的受體及其配體、IFN-I、IFN-II、IL-4和IL-10的表達(dá)肺組織中發(fā)揮作用的galectin蛋白分子包括galectin-1、3、8和9。我們的結(jié)果顯示,在感染后5天和7天,單感染組小鼠和乳糖阻斷感染組小鼠的肺組織中只有g(shù)alectin-9顯著表達(dá),而MLN中g(shù)alectin-3、8和9均有高表達(dá)。Galectin-9的受體Tim-3、CD44、CD137和PDI在本模型中皆高表達(dá)。用乳糖阻斷galectin-9與其受體的結(jié)合后,Tim-3的另一配體HMGB1及CD44的另一配體HA的相關(guān)酶HAS1-3的表達(dá)在感染后第5天皆有代償性升高。乳糖阻斷后,小鼠肺組織IFN-α、β和γ表達(dá)水平在感染后第5天顯著升高,然而IFN-α和β在第7天顯著降低;MLN中IFN-α和β表達(dá)水平在第5天顯著降低,IFN-α、β和γ在第7天顯著降低。乳糖阻斷后,IL-4表達(dá)水平在肺組織于感染后第5天顯著升高,在MLNs于感染后7天顯著降低,IL-10表達(dá)水平在肺組織于感染后5天和7天顯著升高,在MLNs于感染后5天顯著升高。(4)乳糖阻斷促進(jìn)感染小鼠肺部巨噬細(xì)胞浸潤相比于單感染組小鼠,乳糖阻斷感染組小鼠CD68+巨噬細(xì)胞的數(shù)量在感染后7天顯著升高。(5)BALF和肺組織中的巨噬細(xì)胞高表達(dá)galectin-9和Tim-3與對(duì)照組(正常對(duì)照組和乳糖對(duì)照組)相比,單感染組和乳糖阻斷感染組小鼠BALF中CD68+巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的galectin-9和Tim-3熒光信號(hào);同樣,肺組織中表達(dá)galectin-9和Tim-3的CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)目更多。(6)乳糖阻斷促進(jìn)感染小鼠肺部的細(xì)胞凋亡乳糖阻斷感染組小鼠在感染后5天和7天的肺部凋亡細(xì)胞數(shù)目均較單感染組小鼠顯著增加。乳糖阻斷感染組小鼠肺部凋亡細(xì)胞在感染后第7天比在第5天顯著增多。(7)Galectin-9/Tim-3通路抑制Pb ANKA刺激后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IFN-I的表達(dá)Pb ANKA刺激后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞高表達(dá)galectin-9、Tim-3、HAS-3、IFN-I(IFN-α、β)、IFN-II(IFN-γ)和IL10。然而用乳糖阻斷galectin-9與Tim-3的結(jié)合后,IFN-α、β的表達(dá)顯著升高。3)結(jié)論1.用α-乳糖阻斷伯氏瘧原蟲感染小鼠體內(nèi)Galectin蛋白,特別是Galectin-9及其受體,發(fā)現(xiàn)小鼠的死亡率和血蟲率均升高,肺組織炎癥和病理損傷加重,肺組織巨噬細(xì)胞浸潤增多,凋亡細(xì)胞數(shù)量增加。2.m RNA檢測顯示,小鼠肺和MLN組織HMGB1和HAS1-3的表達(dá)在乳糖阻斷后顯著升高,這可能與阻斷后肺病理損傷加重有關(guān)。3.m RNA檢測顯示,小鼠肺組織IFN-I的表達(dá)在乳糖阻斷后顯著升高,進(jìn)而導(dǎo)致感染小鼠血蟲率的升高、病理損傷加重,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。4.m RNA檢測顯示,小鼠肺和MLN組織IL-10的表達(dá)在乳糖阻斷后顯著升高,這可能與阻斷后血蟲率的升高和肺病理損傷加重有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：伯氏瘧原蟲 急性肺損傷 galecin-9 Tim-3 巨噬細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R-332;R531.3
【目錄】：

• 中文摘要3-9
• 英文摘要9-17
• 中英文縮略詞匯表17-20
• 前言20-24
• 第一章 Galectin-9/Tim-3 在伯氏瘧原蟲感染急性肺損傷小鼠模型中的表達(dá)24-48
• 1 材料和試劑24-27
• 2 實(shí)驗(yàn)方法27-31
• 3 結(jié)果31-46
• 4 討論46-47
• 5 小結(jié)47-48
• 第二章 阻斷galectins加重伯氏瘧原蟲感染小鼠急性肺損傷48-77
• 1 材料和試劑48
• 2 實(shí)驗(yàn)方法48-53
• 3 結(jié)果53-71
• 4 討論71-76
• 5 小結(jié)76-77
• 全文總結(jié)77-78
• 參考文獻(xiàn)78-86
• 攻讀研究期間獲得的科研成果86-87
• 攻讀研究期間獲得的學(xué)術(shù)獎(jiǎng)勵(lì)87-88
• 致謝88

  本文關(guān)鍵詞：Galectin蛋白家族在伯氏瘧原蟲感染急性肺損傷小鼠模型中的作用機(jī)制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：283684