目的:本研究通過腹腔注射弓形蟲(RH)速殖子及巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞體外共培養(yǎng)感染弓形蟲速殖子構(gòu)建急性弓形蟲感染模型,分析IL-33~(-/-)小鼠急性弓形蟲感染時(shí)巨噬細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的趨化作用,探討IL-33在小鼠弓形蟲感染時(shí)的免疫功能。方法:1.基因型鑒定:應(yīng)用PCR技術(shù)鑒定C57BL/6 IL-33~(-/-)小鼠基因型;2.生存率比較:C57BL/6野生型和IL-33~(-/-)小鼠腹腔注射弓形蟲RH株10~4個(gè)速殖子,1mL/只,對(duì)照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水,繪制小鼠生存曲線;3.組織病理學(xué)變化:C57BL/6野生型和IL-33~(-/-)小鼠腹腔注射弓形蟲RH株速殖子10~4個(gè),1mL/只,對(duì)照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水,分別于感染后48h和96h分離肝、脾及腦組織進(jìn)行HE染色比較各種組織病理變化;4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分析IL-33~(-/-)對(duì)急性弓形蟲感染小鼠脾臟Th1亞群分化和趨化因子受體表達(dá)的影響:腹腔注射弓形蟲速殖子感染C57BL/6野生型和IL-33~(-/-)小鼠,分別于感染后48h及96h,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染組與未感染組脾臟Th細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ及表面CD195(CCR5)表達(dá)情況;5.體外實(shí)驗(yàn)探討IL-33~(-/-)對(duì)弓形蟲感染時(shí)巨噬細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞趨化作用的影響:5.1.T細(xì)胞表面趨化因子受體表達(dá)分析:分離腹腔巨噬細(xì)胞與脾臟T細(xì)胞共培養(yǎng),感染弓形蟲,于感染后24h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染組與未感染組脾臟T細(xì)胞表面CD69及CD195、CD183(CXCR3)、CD186(CXCR6)表達(dá)情況;5.2.共培養(yǎng)上清液中趨化因子濃度分析:脾臟T細(xì)胞與腹腔巨噬細(xì)胞體外共培養(yǎng)同時(shí)感染弓形蟲24h,ELISA檢測(cè)C57BL/6野生型和IL-33~(-/-)小鼠感染前后共培養(yǎng)上清中CCL5、CXCL16、CXCL9濃度;5.3.T細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn):提取C57BL/6野生型和IL-33~(-/-)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞與脾臟T細(xì)胞共培養(yǎng)于Transwell小室,于感染后12h、16h、20h及24h,分別計(jì)數(shù)感染10~2劑量組、10~4劑量組及未感染組進(jìn)入下室的T細(xì)胞數(shù)目;6.統(tǒng)計(jì)分析方法:使用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Kaplan-Meier法(K-M法)比較野生型和IL-33~(-/-)型小鼠感染與未感染弓形蟲時(shí)生存率的差異,描繪小鼠生存曲線,對(duì)于服從正態(tài)分布的資料,采用One-way ANOVA(單因素分析),分析比較流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果,P0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.鑒定出實(shí)驗(yàn)所用小鼠為C57BL/6野生型和IL-33基因敲除型;2.腹腔感染弓形蟲,IL-33~(-/-)小鼠生存時(shí)間長于野生型小鼠(P0.05);3.感染小鼠肝組織呈慢性肝炎表現(xiàn),野生型小鼠病理改變比IL-33~(-/-)小鼠更嚴(yán)重;感染小鼠脾臟,脾竇破裂,脾索走行紊亂,野生型病理改變比IL-33~(-/-)小鼠更嚴(yán)重;感染腦組織,表現(xiàn)為神經(jīng)元急性壞死,IL-33~(-/-)小鼠出現(xiàn)神經(jīng)血管袖套樣改變,較野生型病理改變更嚴(yán)重;4.弓形蟲經(jīng)腹腔感染野生型及IL-33~(-/-)小鼠,IL-33~(-/-)小鼠未感染組脾臟Th1細(xì)胞的比例高于野生型未感染組(84.33±3.11%比52.66±7.60%,P0.01);IL-33~(-/-)小鼠未感染組Th1表面CD195分子表達(dá)量高于感染組(194.50±9.52%比99.00±3.87%,P0.01);IL-33~(-/-)小鼠感染組與野生型感染組Th1細(xì)胞比例及CD195分子表達(dá)均無顯著性差異;5.弓形蟲感染巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞體外共培養(yǎng)24小時(shí),IL-33~(-/-)小鼠未感染組T細(xì)胞表面CD69、Th1細(xì)胞表面CD195、CD183分子均高于野生型未感染組(分別為:409.85±11.38%比312.43±26.33%,P0.05;180.14±26.53%比121.00±16.68%,P0.05;166.14±14.42%比114.00±12.60%,P0.05);野生型未感染組Th1細(xì)胞表面CD186分子表達(dá)量高于野生型感染組(207.00±19.35%比101.28±19.01%,P0.05);6.巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞體外共培養(yǎng)上清中,CCL5在IL-33~(-/-)小鼠感染弓形蟲后顯著升高(1377.21±126.29%比1062.09±192.59%,P0.05);CXCL9在野生型感染后較IL-33~(-/-)小鼠感染后升高顯著(280.66±84.62%比183.86±63.56%,P0.05);CXCL16野生型感染組升高較IL-33~(-/-)小鼠感染組更顯著(8210.41±962.21%比3493.38±359.42%,P0.01);7.體外巨噬細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn),未感染組及感染10~2劑量組各時(shí)間點(diǎn)比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,感染10~4劑量組,IL-33~(-/-)小鼠感染24小時(shí)趨化T細(xì)胞的數(shù)目明顯高于12小時(shí)(7.17±5.39%比2.43±1.53%,P0.05)。結(jié)論:1.急性弓形蟲感染,IL-33~(-/-)小鼠較野生型小鼠生存率提高,提示IL-33基因敲除對(duì)小鼠弓形蟲感染具有保護(hù)作用。2.體內(nèi)及體外弓形蟲感染實(shí)驗(yàn),IL-33~(-/-)小鼠弓形蟲感染組與野生型感染組比較,巨噬細(xì)胞對(duì)Th1細(xì)胞亞群分化、活化及趨化效應(yīng)均無明顯差異,提示IL-33~(-/-)發(fā)揮的保護(hù)作用可能不是通過促進(jìn)Th1亞群細(xì)胞免疫功能發(fā)揮抗感染作用,具體機(jī)制需進(jìn)一步討論。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R531.8
【部分圖文】：

感染與未感染弓形蟲時(shí)生存率的差異，描繪小的資料，采用 One-way ANOVA（單因素分析）果，P＜0.05 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鑒定e[9]等設(shè)計(jì)的野生型和 IL-33-/-兩對(duì)引物序列，采凝膠電泳條帶位于 489bp 的為野生型，位于 取小鼠鼠尾 DNA 后進(jìn)行 PCR 的結(jié)果。1、2、從吳氏動(dòng)物中心購買的野生型 C57BL/6 小鼠，PCR 結(jié)果理想，符合預(yù)期，進(jìn)行野生型和 IL

和對(duì)照組小鼠的疾病表現(xiàn)，104劑量感染組感染后 3，接著出現(xiàn)閉目、腹部脹大、顫動(dòng)、呼吸急促，最后。用 Kaplan-Meier 法(K-M 法）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較野生，P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IL-33-/-小鼠急性弓形鼠。

野生型與 IL-33-/-小鼠弓形蟲感染組與未感染組生存分析曲線 IL生存率高于野生型感染組（P＜0.05）。腔蟲體計(jì)數(shù)腔感染相同劑量的蟲體，數(shù)天后腹腔內(nèi)蟲體數(shù)量的差異反應(yīng)固有[10]，尤其反應(yīng)腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。圖 1.3 是感染野生型及腔灌洗液姬母薩染色結(jié)果圖，光學(xué)顯微鏡下觀察 IL-33-/-小鼠腹生型鼠。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 聶大平;李偉;申麗潔;尤英霞;;γ-干擾素和白介素抗弓形蟲感染研究進(jìn)展[J];中國病原生物學(xué)雜志;2012年07期

2

本文編號(hào)：2834063