本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導(dǎo)的過(guò)表達(dá)Omp25基因?qū)π∧z質(zhì)細(xì)胞的影響及其分子機(jī)制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的Omp25基因轉(zhuǎn)染小鼠小膠質(zhì)(BV2)細(xì)胞,觀察Omp25蛋白的表達(dá)情況,探索布魯氏桿菌毒力因子Omp25過(guò)表達(dá)對(duì)BV2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)作用,為進(jìn)一步揭示0mp25基因在布魯氏桿菌中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中的分子致病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。方法選取處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的BV2細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為三組:感染Omp25重組慢病毒過(guò)表達(dá)載體(LV-Omp25-GFP組)作為實(shí)驗(yàn)組,感染慢病毒陰性載體組(LV-GFP組)作為陰性對(duì)照組,另設(shè)空白對(duì)照組。感染72h后:在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況,判斷慢病毒轉(zhuǎn)染效率,同時(shí)流式細(xì)胞儀熒光分選穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的BV2細(xì)胞,用于以下實(shí)驗(yàn):(1)電子透射電鏡:觀察慢病毒感染組及空白對(duì)照組細(xì)胞結(jié)構(gòu),觀察細(xì)胞在感染前后超微結(jié)構(gòu)的變化。(2)分別提取各組RNA、DNA,半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中Omp25基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平,從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平驗(yàn)證Omp25表達(dá)成功與否。(3)分別收集LV-Omp25-GFP組、LV-GFP組、空白對(duì)照組細(xì)胞上清液,用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-6、NO的分泌。(4)NF-κB信號(hào)通路特異性抑制劑BAY11-7082 5um預(yù)處理BV2細(xì)胞60min后,加入MOI值為50的LV-Omp25-GFP 50ul感染BV2細(xì)胞,同時(shí)設(shè)置對(duì)照組,72h后收集實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞及培養(yǎng)上清液,RT-PCR及ELISA檢測(cè)炎性因子mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況。多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析,P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果(1)慢病毒感染BV2細(xì)胞72小時(shí)后,在熒光倒置顯微鏡下觀察LV-GFP組和LV-Omp25-GFP組熒光顯微鏡下可見(jiàn)GFP的表達(dá),約有超過(guò)85%的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光,空白對(duì)照組由于未感染慢病毒,熒光顯微鏡下未見(jiàn)GFP的表達(dá)。(2)ELISA結(jié)果顯示,感染72h后,LV-Omp25-GFP組與空白組及LV-GFP組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05),LV-GFP與空白對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)定量PCR結(jié)果顯示:以空白對(duì)照組為1進(jìn)行比較,慢病毒組Omp25基因的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào),其表達(dá)量較空白對(duì)照組和GFP組明顯上調(diào),差異均具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),而GFP組與空白對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。表明BV2細(xì)胞成功過(guò)表達(dá)Omp25基因。(4)Western blot結(jié)果:LV-Omp25-GFP組較對(duì)照組所檢測(cè)灰度值升高,提示Omp25慢病毒感染BV2細(xì)胞后Omp25蛋白成功過(guò)表達(dá)。(5)電子透射電鏡結(jié)果顯示:LV-Omp25-GFP組較對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)長(zhǎng)且豐富的偽足,大量的脂質(zhì)空泡、髓樣小體,線粒體嵴被大量破壞,細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有一些大小不等的吞噬泡,其中含多少不等的慢病毒顆粒凝聚,溶酶體增多。(6)BV2細(xì)胞用BAY11-7082預(yù)處理60min后轉(zhuǎn)染LV-Omp25-GFP,72h收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清,熒光定量及ELISA分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)TNF-α、IL-6、NO的表達(dá)。結(jié)果顯示加入信號(hào)通路抑制劑后能夠明顯抑制Omp25過(guò)表達(dá)慢病毒誘導(dǎo)TNF-α、IL-6、NO的產(chǎn)生,證明NF-κB信號(hào)通路可能參與誘導(dǎo)促炎因子TNF-α、IL-6、NO的產(chǎn)生。結(jié)論建立Omp25慢病毒過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BV2細(xì)胞的模型,推測(cè)BV2細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞將Omp25過(guò)表達(dá)慢病毒顆粒吞噬進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),改變細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;Omp25過(guò)表達(dá)可激活NF-κB信號(hào)通路導(dǎo)致BV2細(xì)胞促炎因子TNF-α、IL-6、NO分泌增多,其可能是神經(jīng)型布魯氏桿菌病的分子機(jī)制之一。
【關(guān)鍵詞】：布魯氏桿菌 Omp25基因 慢病毒 BV2細(xì)胞 NF-κB信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R516.7;R742.9
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 符號(hào)說(shuō)明9-12
• 前言12-14
• 材料與方法14-28
• 結(jié)果28-35
• 討論35-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 文獻(xiàn)綜述44-63
• 綜述參考文獻(xiàn)55-63
• 致謝63-64
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文64-65
• 攻讀學(xué)位期間參與申報(bào)和研究的課題65-66
• 攻讀學(xué)位期間參加的學(xué)術(shù)會(huì)議66

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本文編號(hào)：282999