目的:(1)研發(fā)制備抗多房棘球絳蟲和細粒棘球絳蟲等同表面蛋白Em10單克隆抗體;(2)確定單克隆抗體對不同蟲體發(fā)育階段的識別,以及通過體外培養(yǎng)確定Em10在細粒棘球絳蟲原頭蚴成蟲和成囊雙向分化中的表達;(3)對不同分型包蟲病人組織標本進行識別和鑒定,并且探索單克隆抗體熒光標記后對包蟲感染活體模型的示蹤及抗體在體內(nèi)的代謝,為臨床分子診斷包蟲病和靶向藥物治療奠定基礎(chǔ)。方法:(1)免疫接種:免疫接種BALB/c小鼠,用ELISA方法檢測小鼠抗Em10抗體滴度;(2)細胞融合:采集高滴度小鼠的脾臟,制備脾細胞懸液,將脾細胞與小鼠SP2/0細胞融合,用HAT選擇培養(yǎng)基篩選獲得雜交瘤細胞,并通過ELISA檢測抗體滴度,選擇陽性孔;(3)陽性孔細胞克隆:陽性孔的細胞通過有限稀釋法制備單克隆細胞,篩選分泌抗Em10的克隆細胞,擴增克隆的細胞后儲存于液氮中;(4)BALB/c腹水單克隆抗體的產(chǎn)生:雌性BALB/c小鼠腹腔注射石蠟油,7天后小鼠腹腔注射雜交瘤細胞,注射后10-13天抽取腹水;(5)單克隆抗體的鑒定:用ELISA,Western Blotting和免疫熒光鑒定單克隆抗體;(6)肝包蟲病組織樣本的收集與抗體識別:收集泡型包蟲病人石蠟樣本P1,P2,P3,P4四型30例,囊性包蟲病人石蠟樣本CE1,CE2,CE3,CE4,CE5五型30例,非包蟲病人(肝癌,肝囊腫,肝硬化病人)30例,所有包蟲病標本通過PCR和DNA測序確定包蟲病樣本,用單克隆抗體通過免疫組化確定單克隆抗體對包蟲病陽性和陰性組織標本的識別鑒定;(7)原頭蚴成蟲和成囊雙向發(fā)育中Em10的表達:收集體外培養(yǎng)的原頭蚴,提取不同培養(yǎng)時段的原頭蚴蛋白,用Western Blotting分析原頭蚴雙向發(fā)育中Em10的表達。(8)Em10單克隆抗體對包囊的識別:體外培養(yǎng)原頭蚴培養(yǎng)液每周換2次,培養(yǎng)2個月后,用PBS漂洗微囊,通過腹腔感染小鼠,獲得感染模型,通過小鼠尾靜脈注射200μL/只Cy3熒光素標記單克隆抗體,用小動物活體成像儀動態(tài)觀察抗體與病灶結(jié)合部位。另外,注射終濃度0.5mg/mL Cy3熒光素標記單克隆抗體進入體外培養(yǎng)12個月的包囊,每個包囊注射10-30μL,通過小動物活體成像儀觀察抗原抗體反應(yīng)和熒光標記抗體在包囊內(nèi)的消減。結(jié)果:(1)獲得了能分泌單克隆抗體的2個細胞株,命名為Mab-Em10-8和Mab-Em10-16;其抗體亞型分別為IgG1和IgG2a。用ELISA檢測其細胞培養(yǎng)上清效價達9萬以上,用克隆的單克隆細胞制備小鼠腹水,抗體滴度達100萬以上;用Western Blotting法進行初步鑒定,抗Em10蛋白的兩個單克隆抗體均對重組Em10抗原和蟲體自然蛋白有強的特異性識別。(2)其中Mab-Em10-8單克隆抗體可以與成蟲(AW)、原頭蚴(PSC)自然抗原反應(yīng);(3)Mab-Em10-16單克隆抗體可以較強地識別AW、PSC和包囊生發(fā)層細胞(GL)提取抗原,與囊型包蟲的囊液(HCF)抗原不起反應(yīng)。(4)MabEm10-8與AE包蟲病人組織反應(yīng)的敏感度為56.67%,特異度為100%。Mab-Em10-8能較強地識別P3型AE肝病灶組織,而Mab-Em10-8較強識別CE1-CE3病灶組織,不識別CE4和CE5病灶組織。Mab-Em10-16可以識別AE病灶組織P2-P4型,且P3型靈敏度最高。Mab-Em10-16識別CE病灶組織與Mab-Em10-8相同;(5)Eg和Em原頭蚴的體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),Em原頭蚴較Eg原頭蚴難獲取包囊,且Em與Eg成囊培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)其成囊的形成時間及囊壁厚度的不同,Eg的囊壁比Em厚;(6)通過熒光素標記的單克隆抗體在小鼠體內(nèi)無明顯結(jié)合反應(yīng)。結(jié)論:本次實驗表明Mab-Em10單克隆抗體對泡型和囊型包蟲提取蛋白和組織標本有較好的識別能力,并且與包蟲病人的臨床分型有關(guān),其中Mab-Em10-16可以識別晚期的P3和P4期泡型包蟲病病灶組織,Mab-Em10-8識別P2,P3,P4期泡型包蟲病和CE1-CE3囊型包蟲病病灶組織�？笶m10單克隆抗體的成功研制對包蟲病的診斷和分型有重要的意義,并且研究蟲體的發(fā)育有積極的作用。
【學(xué)位單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R532.32
【部分圖文】：

圖 1-1 Em10 蛋白濃度檢測和 SDS-PAGE 結(jié)果Fig 1-1 Em10 protein concentration detection and purity of recomEm10 on SDS-PAGE表 1-1 第 5 次免疫小鼠檢測不同稀釋梯度小鼠血清效價（ ±s）Table 1-1 Serum titers of mice immunized with Em10 after 5 inje

圖 1-3 3#小鼠第 3、4、5 次免疫后檢測血清 OD405nm值gure 1-3 Detection of serum OD405nm values after 3, 4, andimmunizationsb-Em10 單克隆細胞第一次篩選種 Em10 產(chǎn)生高效價血清小鼠的脾臟，將脾細胞與小鼠 SP

注：Em10-16、19、8、12、4、2、PC 與對照組 NC 相比*P＜0.05圖 1-4 陽性克隆所得細胞株的上清效價Fig 1-4 Anbody titers of positive cell clones (supernatant)

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