發(fā)布時間：2020-09-15 21:36

　　 彎曲菌(Campylobacter)是全球范圍內(nèi)最重要的人獸共患病原菌之一。人類彎曲菌感染輕則引起急性胃腸炎,嚴重時還會導致多種并發(fā)癥。在反芻動物中,胎兒彎曲菌胎兒亞種(Campylobacter fetus subsp.fetus,C.ff)和空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni,Cj)多引起羊散發(fā)性流產(chǎn)和地方流行性流產(chǎn),胎兒彎曲菌性病亞種(Campylobacter fetus subsp.venerealis,C.fv)作為牛生殖道彎曲菌病病原,則引起不育、胚胎早期死亡及流產(chǎn),給畜牧業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。已有研究表明胎兒彎曲菌性病亞種能在牛生殖道定植,常通過人工授精或動物交配途徑引起彎曲菌感染,但對于其他種或亞種的彎曲菌是否存在于牛或其他宿主的生殖道鮮有文獻報道。因此明晰彎曲菌在生殖道中的流行狀況和傳播規(guī)律,對于人和動物彎曲菌病的防控具有重要意義。本研究首先建立了胎兒彎曲菌PCR檢測方法,并結(jié)合現(xiàn)有的彎曲菌分離鑒定方法,對來自人、猴、牛和羊4種宿主的生殖道樣品進行彎曲菌的分離鑒定,初步分析國內(nèi)靈長類和反芻類動物生殖道彎曲菌的流行分布規(guī)律:對生殖道彎曲菌分離株的牛物學特性進行研究,并從基因組水平分析來自生殖道的彎曲菌分離株與腸道彎曲菌分離株的差異,從而為人和動物生殖道中彎曲菌的預防和控制提供數(shù)據(jù)支持。一、胎兒彎曲菌PCR檢測方法的建立及其初步應用以胎兒彎曲菌表面蛋白基因sapB2為靶基因,應用軟件設(shè)計引物,通過反應條件的優(yōu)化,引物敏感性、特異性和靈敏度的試驗以及模擬污染樣品的檢測,建立胎兒彎曲菌PCR快速檢測方法并應用于臨床樣品檢測。結(jié)果顯示本研究建立的PCR方法能特異性擴增胎兒彎曲菌sapB2(789 bp)基因片段,空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌、唾液彎曲菌和豚腸彎曲菌以及其他17株參考菌如大腸桿菌、沙門菌等均未擴增出條帶;胎兒彎曲菌純培養(yǎng)物最低可檢出0.23 pg/μL的DNA,模擬感染樣品污水和奶牛糞便樣品中胎兒彎曲菌的最低檢出量分別為0.9 CFU/mL和20 CFU/g;臨床樣品檢測中,該PCR方法與傳統(tǒng)平板分離法對400份奶牛肛門擦拭樣和125份產(chǎn)婦陰道擦拭樣的檢測結(jié)果一致且均為胎兒彎曲菌陰性,兩類樣品的對照組樣品中,PCR方法的胎兒彎曲菌回收率均為100%,奶牛肛門擦拭樣品平板分離法回收率為80%,產(chǎn)婦陰道擦拭樣平板分離法回收率為100%。本研究所建立的胎兒彎曲菌PCR檢測方法具有特異性強、敏感度高、簡便快速等特點,為胎兒彎曲菌的快速檢測提供了技術(shù)支持,對識別該菌株的爆發(fā)流行,相關(guān)疾病的診斷和控制具有重要意義。二、不同宿主生殖道的彎曲菌流行病學調(diào)查于2017年3月至2018年6月期間,于揚州市某醫(yī)院采集1128名孕婦的生殖道擦拭樣及肛拭樣,包括269例流產(chǎn)病例,收集其流產(chǎn)胎盤269份;于蘇州和上海采集101只母猴的生殖道擦拭樣及肛拭樣;于揚州市某奶牛場采集455頭健康奶牛和17頭牛流產(chǎn)奶牛的生殖道擦拭樣及肛拭樣,采集流產(chǎn)奶牛胎盤及死胎的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎和胃內(nèi)容物;于江蘇省的海安、鹽城、盱眙、江都和漣水采集368頭母羊的生殖擦拭樣和肛拭樣,及225份環(huán)境樣。共采集了 2126份生殖道樣品、2126份肛拭樣及225份環(huán)境樣。彎曲菌的分離鑒定結(jié)果顯示,從人、猴、牛和羊的生殖道樣中共分離到7株空腸彎曲菌、2株結(jié)腸彎曲菌、1株唾液彎曲菌及1株豚腸彎曲菌,所有樣品均未分離到胎兒彎曲菌。其中空腸彎曲菌能從4種宿主的生殖道中被分離到,結(jié)腸彎曲菌在猴和羊的生殖道中被分離到,唾液彎曲菌和豚腸彎曲菌僅在牛的生殖道中被分離到。醫(yī)院采集的孕婦生殖道樣品中分離到1株彎曲菌且為空腸彎曲菌,陽性率為0.09%,肛拭樣共分離到2株彎曲菌,總陽性率為0.18%,生殖道樣和肛拭樣彎曲菌陽性率無顯著性差異(P0.05);健康孕婦和流產(chǎn)個體生殖道彎曲菌分離率分別為0.12%和0,無顯著性差異(P0.05);流產(chǎn)個體和健康個體的肛拭樣彎曲菌分離率分別為0.37%和0.12%,無顯著性差異(P0.05);269份胎盤樣品未分離到彎曲菌。猴源生殖道擦拭樣及肛拭樣分別分離到3株和24株彎曲菌,總陽性率為2.57%和20.69%,生殖道樣的彎曲菌陽性率顯著低于肛拭樣(P0.05);母猴生殖道樣分離到空腸彎曲菌2株,陽性率為1.72%,結(jié)腸彎曲菌1株,陽性率為0.86%;肛拭樣中分離到空腸彎曲菌6株,陽性率為5.17%,結(jié)腸彎曲菌14株,陽性率為12.07%,其他彎曲菌屬4株,陽性率為3.45%。116只母猴來自兩種不同養(yǎng)殖模式,大籠群養(yǎng)和獨籠養(yǎng)殖母猴生殖道樣品彎曲菌總陽性率分別為3.16%和0,肛拭樣彎曲菌總陽性率分別為24.21%和4.76%,大籠群養(yǎng)模式的母猴生殖道和腸道彎曲菌陽性率均顯著高于獨籠養(yǎng)殖模式(P0.05)。羊源生殖道樣和肛拭樣的彎曲菌總陽性率分別為0.73%和13.41%,生殖道樣的彎曲菌陽性率顯著低于肛拭樣(P0.05)。410份母羊生殖道樣品共分離到2株空腸彎曲菌和1株結(jié)腸彎曲菌,陽性率分別為0.49%和0.24%。6周內(nèi)4次追蹤采樣一母羊群,正常飼養(yǎng)組和被接種李斯特菌組的生殖道樣品均未分離到彎曲菌,正常飼養(yǎng)組肛拭樣彎曲菌總陽性率從90.00%持續(xù)下降至37.50%,被接種李斯特菌組肛拭樣彎曲菌總陽性率分別為100.00%、100.00%、88.89%和88.89%,連續(xù)6周處于一個較高的彎曲菌陽性水平。分群飼養(yǎng)的母羊群和公母混養(yǎng)的羊群生殖道樣品彎曲菌分離率分別為0和1.48%,肛拭樣彎曲菌分離率分別為0.97%和26.11%,差異顯著(P0.05)。羊源正常散養(yǎng)的羊群和經(jīng)過長途運輸羊群的生殖道樣品彎曲菌分離率分別為1.61%和0,肛拭樣彎曲菌分離率分別為25.81%和95.00%,長途運輸后的羊群肛拭樣彎曲菌分離率顯著高于正常散養(yǎng)的羊群(P0.05),但其生殖道彎曲菌分離率并未升高。牛源455頭健康奶牛和17頭牛流產(chǎn)奶牛的生殖道樣彎曲菌陽性率分別為0.88%和0,均處于一個較低的感染水平,其中455頭健康奶牛生殖道樣品中分離到2株空腸彎曲菌、1株唾液彎曲菌和1株豚腸彎曲菌,分離率分別為0.44%、0.22%和0.22%。17頭牛流產(chǎn)奶牛的生殖道擦拭樣、胎盤及死胎臟器樣品中均未分離到彎曲菌。健康奶牛和流產(chǎn)奶牛肛拭樣彎曲菌陽性率分別為3.74%和5.88%,無顯著性差異(P0.05)。三、生殖道彎曲菌分離株生物學特性及分子特征分析為了探究來自生殖道的彎曲菌分離株與其他生態(tài)位如腸道的彎曲菌分離株是否存在差異,我們對彎曲菌分離株的運動力、趨化性等生物學特性進行了研究,并通過全基因組測序手段,對來自生殖道和腸道的彎曲菌分離株進行了基因組的比較分析。運動力實驗結(jié)果從菌種水平上分析,生殖道空腸彎曲菌分離株與肛拭樣分離株的運動力平均直徑分別為4.94 cm和5.05 cm,無明顯差異,而結(jié)腸彎曲菌和唾液彎曲菌的運動力平均直徑均大于肛拭樣分離株。乳酸耐受能力從菌種水平上分析,生殖道空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌和唾液彎曲菌分離株的乳酸耐受能力均強于肛拭樣分離株,其在乳酸MH溶液中于37℃下作用8 min后的平均減少量分別為1.53、1.49、1.10個數(shù)量級和1.60、1.93、2.15個數(shù)量級。硬瓊脂法進行趨化性分析,從菌種水平上看來,生殖道空腸彎曲菌分離株在趨化物DL-蘋果酸和丁二酸中均表現(xiàn)出比肛拭樣分離株更強的趨化性;生殖道結(jié)腸彎曲菌分離株在三種趨化物中均表現(xiàn)出比肛拭樣分離株更強的趨化性;生殖道唾液彎曲菌分離株在α-酮戊二酸和丁二酸中均表現(xiàn)出比肛拭樣分離株更強的趨化性。細胞黏附侵襲從菌種水平上來看,生殖道空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌和唾液彎曲菌分離株對Caco-2細胞和CHO細胞的黏附和侵襲能力均強于肛拭樣分離株,且對CHO細胞的黏附和侵襲能力強于Caco-2細胞。從整體水平上看來,大多數(shù)情況下生殖道彎曲菌分離株在運動力、乳酸耐受能力、趨化性以及對Caco-2和CHO兩種細胞的黏附侵襲能力上均強于肛拭樣分離株。因此我們推測,這些能在生殖道中生存的彎曲菌在某些生物學特性上存在一定的優(yōu)勢,使其能夠生殖道這種存在脅迫因子的惡劣環(huán)境中得以生存。進行進化關(guān)系分析顯示,生殖道彎曲菌分離株與肛拭樣分離株程交叉分布。生殖道彎曲菌分離株與肛拭樣彎曲菌分離株在CDS數(shù)量上沒有明顯差異。生殖道彎曲菌分離株基因組的總堿基數(shù)量和平均GC(%)含量均低于肛拭樣分離株,可能與適應性進化有關(guān)。MLST分析顯示,生殖道彎曲菌分離株與肛拭樣分離株有3個同源復合體類型(ST-21,ST-22,ST-828)相同,表明宿主生殖道中感染的彎曲菌的同源復合體類型并不是特異的;生殖道彎曲菌分離株與肛拭樣分離株有2個ST型(2和4253)相同,說明宿主生殖道中感染的彎曲菌ST型并不是特異的。細菌基因組的11類毒力基因數(shù)量統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,生殖道彎曲菌分離株與肛拭樣彎曲菌分離株之間并未發(fā)現(xiàn)明顯的差異和規(guī)律。
【學位單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R535
【部分圖文】：

圖３＊４分離株對Ｃａｃｏ－２細胞和ＣＨＯ細胞的相對黏附、侵襲率逡逑Ｆｉｇ邋３－邋４邋Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ａｄｈｅｓｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｉｎｖａｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｃａｃｏ－２邋ａｎｄ邋ＣＨＯ邋ｂｙ邋Ｃａｍｙｌｏｂａｃｔｅｒ邋ｉｓｏｌａｔｅｓ逡逑Ａ、Ｂ、Ｃ和Ｄ分別是空腸彎曲菌對Ｃａｃｏ－２細胞和ＣＨＯ細胞的相對黏附、侵襲率結(jié)果圖；Ｅ、Ｆ、逡逑Ｇ、和Ｈ是結(jié)腸彎曲菌對Ｃａｃｏ－２細胞和ＣＨＯ細胞的相對黏附、侵襲率結(jié)果圖；Ｉ、Ｊ、Ｋ和Ｌ分別逡逑是唾液彎曲菌對Ｃａｃｏ－２細胞和ＣＨＯ細胞的相對黏附、侵襲率結(jié)果圖；Ｍ、Ｎ和０分別是空腸彎逡逑曲菌、結(jié)腸彎曲菌和唾液彎曲菌對Ｃａｃｏ－２細胞和ＣＨＯ細胞的相對黏附、侵襲率的整體水平分布情逡逑況逡逑

０邐５００邐１０００邐１５００邐２０００邐２５００逡逑Ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆＣＤＳｓ逡逑圖３－８細菌基因組ＣＤＳ含量逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－８邋Ｂａｒｐｌｏｔ邋ｏｆ邋ＣＤＳｓ邋ｉｎ邋ｐｅｒ邋ｇｅｎｏｍｅ．逡逑３．２．４邋ＧＣ邋含量逡逑生殖道分離株中，除了結(jié)腸彎曲菌Ｍ１８８Ｓ外，其余所有生殖道分離株ＧＣ邋（％）含量逡逑

逑Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ邋Ｇｅｎｉｔａｌ逡逑圖３－７細菌基因組堿基含量逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－７邋Ｂａｓｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｏｆ邋Ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋Ｇｅｎｏｍｅ逡逑３．２．３基因組ＣＤＳ數(shù)量逡逑生殖道彎曲菌分離株與肛拭樣彎曲菌分離株ＣＤＳ數(shù)量上沒有明顯差異。逡逑丨邐Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ邋Ｇｅｎｉｔａｌ逡逑１邐：■邐Ｈ邐ｍｏｎｋｅｙ逡逑邐邐Ｈ邐Ｉ邐ｓｈｅｅｐ逡逑Ｈ邐ｈｕｍｆｌｎ逡逑邐ｍｍ邐Ｈｉ邐ｃｏｗ逡逑邐邋邐Ｙ＾ＨＨｉｉａｉａｉｉｉｉｉａａａｉｉＭ邐２２００邋＊］逡逑邐Ｉ—邐＊邐邋■■■■■■■■■■■邐２０００－邐－ｊ—逡逑￣Ｉ—邐娜，—邐ｉ８00－邋ｒ邐＼逡逑—邐ｉ邐■邐■■逡逑邐－邋１６００－逡逑＼——似邋ｍａｍｓ＾ｓｓｍ＾ｍｓ＾逡逑：：ｒＳＳＳＳＳＳＳＳ１１１１邋１４００＾—？邐？—逡逑——邐邐邐邐邋Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ邋Ｇｅｎｉｔａｌ逡逑ｉ邐邐邐逡逑邐邋ｉ邐ｖ？ｊ邋ＢＡＳＳＳｉＳＳｆｉｆｌＫＳｉＳＳ＾ＱＳｉＳｉＳＫＳＳ逡逑邐逡逑—￣：——■邋？逡逑０邐５００邐１０００邐１５００邐２０００邐２５００逡逑Ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆＣＤＳｓ逡逑圖３－８細菌基因組ＣＤＳ含量逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－８邋Ｂａｒｐｌｏｔ邋ｏｆ邋ＣＤＳｓ邋ｉｎ邋ｐｅｒ邋ｇｅｎｏｍｅ．逡逑３．２．４邋ＧＣ邋含量逡逑生殖道分離株中，除了結(jié)腸彎曲菌Ｍ１８８Ｓ外，其余所有生殖道分離株ＧＣ邋（％）含量逡逑

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