發(fā)布時間：2020-09-05 06:54

　　 目的(1)探索左旋多巴(L-DOPA)作用于馬爾尼菲籃狀菌(Talaromyces marneffei,TM)后其產黑素的菌株較不產黑素的菌株蛋白表達有何差異。(2)對差異蛋白結果進行生物信息學的分析,了解差異蛋白所富集的主要生物學通路,對黑素產生時的細胞內部生物學過程有初步的了解。(3)選取感興趣的差異蛋白點進一步分析,希望發(fā)掘治療馬爾尼菲籃狀菌感染潛在的藥物治療靶點。方法(1)在含L-DOPA及不含L-DOPA的ANM固體培養(yǎng)基上避光培養(yǎng)Frr2161,37℃7天。(2)菌體蛋白通過Novagen的Yeast Buster proteins extraction reagent進行提取,并用2-D Quant-kit試劑盒進行蛋白定量。(3)利用雙向凝膠電泳分離總蛋白,銀染顯色后用ImageMaster 2D platinum 5.0分析軟件對膠圖進行分析,找到差異蛋白點。(4)通過基質輔助激光解析/電離-飛行時間串聯(lián)質譜(MALDI-TOF/TOF MS)獲取肽質量指紋譜,利用MASCOT搜庫(UniProt數據庫)鑒定出差異蛋白點。(5)將鑒定出的差異蛋白進行GO和pathway的分析。(6)利用RT-qPCR對感興趣的蛋白進行驗證。(7)在含格爾德霉素與不含格爾德霉素的BHI培養(yǎng)基上培養(yǎng)TM,通過肉眼、熒光顯微鏡及透射電鏡觀察格爾德霉素對TM有何影響。結果(1)經雙向凝膠電泳分離總蛋白后總共得到38個差異蛋白點,其中在產黑素的TM中高表達的蛋白點15個,新出現(xiàn)的蛋白點16個,低表達的蛋白點7個。(2)蛋白質譜分析顯示差異蛋白組富集在HSP家族,尤其是HSP90。(3)RT-qPCR的結果顯示HSP90、HSP60、HSP70 mRNA水平在L-DOPA黑素化培養(yǎng)的TM中表達上調,與蛋白組學比較結果一致。(4)GO分析提示熱休克蛋白家族富集在了絕大部分的生物學功能,熱休克蛋白主要富集在壓力應激、細胞加工、蛋白質折疊、生物學進程、對刺激的反應這幾條通路而這些通路同樣是差異蛋白富集較多的通路,pathway分析提示蛋白富集最多的是吞噬體這條通路。(5)在含格爾德霉素的BHI培養(yǎng)基上,肉眼見TM菌落生長受到抑制,黑素生成減少;熒光顯微鏡結果見TM形態(tài)有向菌絲相轉化的趨勢,透射電鏡結果見菌體內電子致密顆粒較不含格爾德霉素的對照組明顯減少,囊泡未見明顯擴張,細胞壁破壞。結論:(1)熱休克蛋白家族尤其是HSP90在TM黑素產生過程中有著活躍的生物學活動。(2)HSP90抑制劑對TM生長和黑素生成有抑制作用。(3)黑素的代謝通路與吞噬體通路密切相關。
【學位單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R756
【部分圖文】：

馬爾尼菲籃狀菌多巴黑素生成調控的相關蛋白組學研究 2018 屆碩士學位論結 果1. ANM 培養(yǎng)基上 TM 的生長情況置于 37℃恒溫箱避光培養(yǎng) 7 天后,觀察菌落顏色的變化（圖 1），可見在不含 L-DOPA 的 ANM 培養(yǎng)基上，菌落呈乳白色酵母樣，培養(yǎng)基透明呈淡黃色未見色素（圖 3-1.a），而在含 L-DOPA 的 ANM 培養(yǎng)基上，菌落呈灰褐色酵母樣，培養(yǎng)基被染成黑色（圖 3-1.b）。

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本文編號：2812703